山西省苹果树腐烂病菌的种群结构分析

殷辉; 周建波; 张志斌; 秦楠; 任璐; 赵晓军

doi:10.13346/j.mycosystema.160112

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菌物学报 ›› 2016, Vol. 35 ›› Issue (12) : 1493-1502. DOI: 10.13346/j.mycosystema.160112 CSTR: 32115.14.j.mycosystema.160112

山西省苹果树腐烂病菌的种群结构分析

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Population structure of Valsa species from Malus pumila in Shanxi Province

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摘要

为明确山西省苹果树腐烂病菌的分布与组成,本研究采集并分离得到来自山西省8个苹果树种植区有代表性的78株腐烂病菌,通过形态特征观察及利用2个DNA片段（ITS和EF1α）构建系统发育树等方法对其遗传结构进行了研究。结果表明山西省苹果树腐烂病由苹果黑腐皮壳菌Valsa mali和梨黑腐皮壳菌Valsa pyri 2个致病种所致,其中V. pyri是优势种,分布于山西省各个苹果树种植区,占菌株总数的58.97%。以山西省8个苹果树种植区腐烂病菌各个种的相对频率进行聚类分析,欧式距离9作为聚类分割点将其种群结构分为3类。第Ⅰ类包括忻州、朔州2个苹果树种植区,V. pyri为该类型苹果树种植区的致病菌、相对频率为100%。第Ⅱ类包括晋城、长治、临汾、太原、运城5个苹果树种植区,V. pyri是这5个种植区的优势种。第Ⅲ类包含晋中1个苹果树种植区,V. mali是该种植区的优势种。

Abstract

The pathogens caused apple Valsa canker were investigated morphologically and phylogenetically (ITS and EF1α) based on 78 isolates from 8 apple planting areas in Shanxi Province. The results show that Valsa spp. from Shanxi Province belong to V. mali and V. pyri. V. pyri is dominant and detected in all apple planting areas in Shanxi Province, accounting for 58.97% of the total number of the strains obtained. Relative frequency of Valsa species from the areas investigated was analyzed by SPSS 19.0, and the species were grouped into three clusters at grouping pointing 9 of euclidean distance. ClusterⅠincludes two apple planting area (Xinzhou and Shuozhou) where the pathogen was V. pyri with the relative frequency of 100%. Cluster Ⅱ includes five apple planting area (Jincheng, Changzhi, Linfen, Taiyuan and Yuncheng), where V. pyri is the dominant species. Cluster Ⅲ includes only one planting area (Jinzhong), where V. mali is the dominant species.

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殷辉, 周建波, 张志斌, 秦楠, 任璐, 赵晓军. 山西省苹果树腐烂病菌的种群结构分析[J]. 菌物学报, 2016, 35(12): 1493-1502 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.160112

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苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属 Valsa spp.引起的一种枝干病害,普遍发生于我国各个苹果树种植区（高克祥和刘晓光 1995;陈策 2009）。近年来,我国苹果树腐烂病发生日趋严重,在陕西（王磊等 2005;李正鹏等 2013）、辽宁（吴玉星等 2010）、甘肃（牛军强等 2011）、山东（王彩霞等2012）、山西（曹克强等 2009;张润祥等 2011）、河南（周增强等 2015）、云南（桂腾茸等 2014）等果区均有不同程度的发生。2009年山西省苹果树腐烂病发生面积为17万公顷,2010年为20万公顷（张润祥等 2011）。2014-2015年,本课题组调查发现在山西省苹果主栽区（运城、临汾）腐烂病平均病株率高达74.5%。

Valsa spp.可以侵染多种植物（苹果、海棠、梨、桃、沙果、樱桃、梅、梨、杨树、柳树、桑树等）导致发生腐烂病（陈策 2009;孙祥瑞等 2010）,来源于不同的寄主及不同培养条件下Valsa spp.的菌落特征会在一定范围内变化（Wang et al. 2011）。因此,同种异名的情况时有发生,如 V. ceratosperma (Tode:Fr.) Maire的分类始终存在争议（Saito et al. 1972;Lee et al. 2006;Suzaki 2008;Wang et al. 2014）。随着分子生物学技术的发展,特别是应用rDNA-ITS已准确鉴定了由Valsa spp.引起的多种果树腐烂病菌（Adams et al. 2002,2005,2006）。国外学者通过同工酶谱、rDNA-ITS酶切图谱及系统发育学结合形态学等手段将 V. ceratosperma (Tode:Fr.) Maire划分为 3个不同的种V. fabianae、V. ceratosperma sensu stricto和 V. ceratosperma sensu Kobayashi（Lee et al. 2006;Adams et al. 2005;Suzaki 2008）。Wang et al.（2014）依据菌落特征、致病性及序列的差异将V. mali var. mali和 V. mali var. pyri重新命名为苹果黑腐皮壳菌V. mali和梨黑腐皮壳菌V. pyri。目前,我国的苹果树腐烂病菌由V. mali、V. pyri、V. malicola、 V. persoonii 4个致病种组成,V. mali是我国苹果树腐烂病的优势种（Wang et al. 2011,2014）,然而,由于其取样点及数量的局限性,并未涵盖山西省各个苹果树种植区。

山西省是我国苹果重要的生产基地之一,苹果树主要分布于黄河故道和黄土高原地区,有其独特的种植结构和地理环境（Bills & Polishook 1991;农业部种植管理业司 2007）。但是,山西省苹果树腐烂病菌的种群结构并未明确,亟需系统研究山西省苹果树腐烂病菌,为腐烂病的防治提供科学依据。

本研究采集并分离了来自山西省8个苹果树种植区的腐烂病标本,通过形态特征观察和利用2个DNA片段（ITS和EF1α）构建系统发育树进行研究,进而明确山西省苹果树腐烂病菌的种群结构。

1 材料与方法

1.1 病原菌采集与分离

本实验供试标本主要采集自山西省运城、临汾、晋中、忻州、朔州、晋城、太原、长治等8个苹果树种植区（表1、图3B）。采用组织分离法分离菌株（王玉春等 2015）,进一步纯化得到单孢分离菌株（Wang et al. 2011）、4℃保存菌种。

表1 供试腐烂病菌菌株编号及来源

Table 1 Information of Valsa species from Shanxi Province

种 Species	采集地 Origin	菌株 Strain	菌株数 Number of strains	相对频率 Relative frequency (%)
V. mali	运城 Yuncheng	YC0136, YC102, YC095, YC90, YC086, YC083, YC077	7	46.7
	临汾 Linfen	LF097, LF095, LF092, LF043, LF015	5	41.7
	晋中 Jinzhong	JZ159, JZ149, JZ144, JZ146, JZ135, JZ064 JZ069, JZ065, JZ060, JZ049	10	66.7
	忻州 Xinzhou	--	0	0
	朔州 Shuozhou	--	0	0
	晋城 Jincheng	JC206, JC202, JC199	3	33.3
	太原 Taiyuan	TY133, TY135, TY129, TY121	4	44.4
	长治 Changzhi	CZ190, CZ179, CZ165	3	37.5
V. pyri	运城 Yuncheng	YC050, YC049, YC047, YC046, YC45 YC071, YC044, YC048	8	53.3
	临汾 Linfen	LF039, LF037, LF035, LF031, LF030, LF027, LF023	7	58.3
	晋中 Jinzhong	JZ134, JZ128, JZ125, JZ120, JZ115	5	33.3
	忻州 Xinzhou	XZ178, XZ175, XZ173, XZ074, XZ073	5	100
	朔州 Shuozhou	SZ212, SZ211, SZ210, SZ209, SZ207	5	100
	晋城 Jincheng	JC209, JC208, JC201, JC185, JC183, JC180	6	66.7
	太原 Taiyuan	TY132, TY130, TY120, TY118, TY117	5	55.6
	长治 Changzhi	CZ200, CZ197, CZ195, CZ189, CZ186	5	62.5

	Note: There are 4 strains (JZ069, JZ065, JZ060, JZ049) from Taigu county of Jinzhong city and all of them are Valsa mali; there are 3 strains (YC071, YC044, YC048) from Yanhu district of Yuncheng city and all of them are V. pyri.
	注：在晋中市太谷县分离出4株菌（JZ069、JZ065、JZ060、JZ049）,全部为Valsa mali;在运城市盐湖区分离分离出3株菌（YC071、YC044、YC048）,全部为V. pyri.

1.2 形态学观察

在PDA平板培养3d的菌株,取菌饼（直径5mm）接种于新PDA平板中央培养,重复3 次。22℃、12h光照/12h黑暗培养2d后测量菌落直径并记录菌落特征（Li et al. 2011;Wang et al. 2011）。

1.3 DNA提取及PCR扩增

依据参考文献（臧睿等 2007;臧睿 2012;Wang et al. 2011,2014）对菌株形态学的研究结果选择代表性菌株,收集培养5d后的菌丝,使用柱式抽提试剂盒[（生工生物工程（上海）股份有限公司）]提取DNA,PCR扩增ITS和EF1α 2个DNA片段。应用引物ITS1-F（Gardes & Bruns 1993）和ITS4（White et al. 1990）扩增ITS序列,扩增条件参照Wang et al.（2011）的方法进行;应用引物EF1-728F和EF1-986R（Carbone & Kohn 1999）扩增EF1α序列,扩增条件参照Wang et al.（2014）的方法进行。扩增产物纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 系统发育分析

在GenBank中下载所需的参考序列（表2）。使用ClustalX 2.1软件对基因序列进行比对分析（Thompson et al. 1997）。使用PAPU 4.0软件以邻接法（neighbor-Joining,NJ）构建系统发育树（Swofford 2002）。

表2 23株山西省苹果树腐烂病菌的rDNA-ITS和EF1α的GenBank登入号

Table 2 Isolates and GenBank accession numbers of 23 isolates of Valsa species from Shanxi Province

Species	Origin	Isolates	GenBank accession numbers of Valsa species
Species	Origin	Isolates	ITS	EF1α
V. pyri	运城 Yuncheng	YC047	KX196239	KX273798
	运城 Yuncheng	YC046	KX196257	KX273802
	临汾 Linfen	LF035	KX196253	KX273805
	晋中 Jinzhong	JZ120	KX196251	KX273799
	晋中 Jinzhong	JZ125	KX196247	KX273820
	忻州 Xinzhou	XZ073	KX196238	KX273809
	忻州 Xinzhou	XZ175	KX196245	KX273807
	朔州 Shuozhou	SZ211	KX196237	KX273808
	朔州 Shuozhou	SZ210	KX196258	KX273803
	晋城 Jincheng	JC209	KX196248	KX273800
	晋城 Jincheng	JC201	KX196246	KX273804
	太原 Taiyuan	TY130	KX196243	KX273819
		TY118	KX196240	KX273801
		TY132	KX196242	KX273810
	长治 Changzhi	CZ195	KX196259	KX273806
V. mali	运城 Yuncheng	YC102	KX196256	KX273812
	临汾 Linfen	LF095	KX196249	KX273816
	晋中 Jinzhong	JZ159	KX196255	KX273817
		JZ144	KX196241	KX273811
		JZ064	KX196244	KX273814
	长治 Changzhi	JC206	KX196254	KX273813
	太原 Taiyuan	TY121	KX196252	KX273815
	长治 Changzhi	CZ190	KX196250	KX273818
V. pyri		Vp134	JN662366	JQ900325
		Vp014	JN673554	JQ900327
V. mali		Vm 008	JN412599	JQ900314
		Vm 024	GU174588	JQ900313
		Vm 142	JN792572	JQ900309
		Vm 143	JN792571	JQ900310
V. malicola		Vmlicola 001	JN545839	JQ900336
		Vmlicola 136	GU174579	JQ900335
		Vmlicola 137	GU174578	JQ900334
V. leucostoma		Vleucostoma 32W	JN584644	JQ900339

Note: Sequences for Vp014, Vp134, Vm008, Vm024, Vm142, Vm143, Vmalicola 001, Vmalicola 136, Vmalicola 137 and Vleucostoma 32W were obtained from GenBank.

1.5 数据分析

采用相对频率表示苹果树腐烂病菌在各个种植区的分布偏好性（刘宏玉等2015）。应用 SPSS 19.0软件将每个地区Valsa spp.的相对频率以欧式距离法进行聚类分析（王术荣等 2016）。根据聚类分析结果,以适当大小作为分割点,将山西省8个苹果树种植区腐烂病菌的种群结构划分为不同类型。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌落形态学特征

以菌株编号为JC206、JZ144、JZ159、CZ190、JZ120、TY130、SZ211和YC046的8个株菌为代表,观察苹果树腐烂病菌在PDA培养基上的菌落形态。基于苹果树腐烂病菌在PDA培养基上菌落的质地、颜色、生长速率及分生分生孢子器大小分为2类。

第一类菌株的菌落正面颜色分灰白色（图1A,C,D）和黄褐色2个类型（图1B）,菌落背面淡黄色、黄褐色,菌丝绒毛状,部分菌株中央菌丝稀疏（图1 A,B,C,D）。灰白色菌株在PDA培养基上的平均生长速率为2.03cm/d,4d后产生分生孢子器（图1C,D）。黄褐色菌株在PDA培养基上的平均生长速率为3.20cm/d,培养期内不产生分生孢子器（图1B）。

图1 山西省苹果树腐烂病菌菌落形态特征 A：JC206;B：JZ144;C：JZ159;D：CZ190;E：JZ120;F：TY130;G：SZ211;H：YC046.

Fig. 1 Morphological characteristics of Valsa species colony from Malus pumila in Shanxi Province. A: JC206; B: JZ144; C: JZ159; D: CZ190; E: JZ120; F: TY130; G: SZ211; H: YC046.

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第二类菌株的菌落呈白色、乳白色,菌丝呈放射状、致密,菌落背面为淡黄褐色（图1E,F,G,H）。在PDA培养基上平均生长速率为3.69cm/d;3d后菌落呈乳白色,产生分生孢子器,分生孢子器附着白色气生菌丝（图1E,F,G,H）。

2.2 系统发育分析

通过分离采自山西省8个苹果树种植区的腐烂病树皮标本,共获得78株菌（表1）。通过菌株形态特征及地区差异筛选出23株菌（同一地区、形态特征相同的菌株图1中未显示）扩增ITS和EF1α基因序列,将得到的序列提交至GenBank （表2）。

利用2个基因（ITS和EF1α）,以 V. leucostoma（Vleucostoma 32w）为外类群构建系统发育树。筛选的23株菌聚类为2个分支（图1）,表明山西省苹果树腐烂病菌归属为V. mali（苹果黑腐皮壳菌）和V. pyri（梨黑腐皮壳菌）2个类群（图2）。其中,15株菌（另31株菌的分布见表1）与V. pyri （Vp014和Vp134）以100%自展支持率聚为同一个分支（图2）,分布于山西省各个苹果树种植区（表1）。其余8株菌（另24株菌的分布见表1）与V. mali（Vm008、Vm024、Vm142、Vm143）以100%自展支持率聚为同一个分支（图2）,分布于山西省运城、临汾、晋中、晋城、太原、长治等6个果区（表1）。

图2 苹果树腐烂病菌系统发育树

Fig. 2 Phylogenetic tree of Valsa species isolated from Malus pumila in Shanxi Province.

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2.3 山西省各个苹果树种植区腐烂病菌的组成与分布

山西省苹果树腐烂病菌归属为V. mali和 V. pyri 2个致病种（图2）,其中V. pyri分布于山西省8个苹果树种植区,占菌株总数的58.97% （图3A）。在山西省晋北果区（忻州、朔州）、运城盐湖区3个苹果树种植区,V. pyri的相对频率为100%（表1、图3A）;在晋中市太谷县果区没有分离到V. pyri（表1）;在运城、临汾、晋中、晋城、太原、长治6个苹果树种植区,V. pyri的相对频率分别为53.33%、58.33%、33.33%、66.67%、55.56%、63.00%（图3A）。V. mali分布于运城、临汾、晋中、晋城、太原、长治6个果区,占菌株总数的41.03% （图3A）;在晋北果区（忻州、朔州）果区没有分离到V. mali（表1、图3A）。

图3 山西省各个苹果树种植区腐烂病菌的组成与分布 A：山西省各个苹果树种植区腐烂病菌的百分比;B：山西省苹果树和梨树种植面积.

Fig. 3 Distribution and species composition of Valsa spp. from apple planting areas in Shanxi Province. A: Composition of Valsa species from different areas; B: Apple and pear tree planting areas in Shanxi Province. : Pear; : Apple.

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2.4 山西省各个苹果树种植区腐烂病菌种群结构聚类分析

以山西省8个苹果树种植区腐烂病菌的相对频率进行聚类分析。结果表明以欧式距离9作为聚类分割点,将8个苹果树种植区腐烂病菌种群结构分为3个类型（图4）。第Ⅰ类包含忻州和朔州2个苹果树种植区（苹果树种植面积与梨树种植面积的比例为1.12:1.94,图3B）,在这2个种植区V. pyri的相对频率为100%;V. pyri是为害忻州和朔州2个苹果树种植区的致病菌（图4）。第Ⅱ类包含晋城、长治、临汾、太原、运城5个苹果树种植区,V. pyri的相对频率介于53%-67%之间;V. pyri是这5个苹果树种植区的优势种（图4）。第Ⅲ类包含晋中1个苹果树种植区（苹果树种植面积与梨树种植面积的比例为3.85:2.31,图3B）;V. pyri的相对频率为33.33%;V. mali为晋中苹果树种植区的优势种（图4）。

图4 山西省8个苹果树种植区腐烂病菌相对频率的聚类分析图

Fig. 4 Relative frequency of Valsa species clustering tree of 8 apple planting areas in Shanxi Province.

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3 结论

苹果树腐烂病是生产中为害严重的枝干病害。了解腐烂病菌群体的组成和分布状况,有助于为针对性的防治提供科学依据。我国苹果树腐烂病菌由 Valsa mali、V. pyri、V. malicola、V. persoonii 4个致病种组成,其中V. mali是我国苹果树腐烂病的主要致病种（Wang et al. 2011,2014）。臧睿（2012）研究我国苹果树腐烂病菌的组成时发现山西省运城地区有5株V. mali和1株V. pyri。本研究发现山西省苹果树腐烂病的致病菌归属为苹果黑腐皮壳菌V. mali和梨黑腐皮壳菌V. pyri,其中V. pyri所占比例较大,相对频率为58.97%;但并未分离到V. malicola和V. persoonii,这与国内外的报道明显不同（Wang et al. 2011,2014;臧睿 2012）,可能由于取样地点的不同和种植结构的差异等原因造成。

山西省地处黄土高原,有其独特的地理环境及种植结构（Bills & Polishook 1991;农业部种植管理业司 2007）。本研究发现山西省苹果树腐烂病菌群体与国内其他省份腐烂病菌群体存在着较大的差异（Wang et al. 2011,2014;臧睿 2012）。病原菌的群体结构与其寄主的种植结构和栽培制度密切相关,在不同的寄主选择压力下其群体适应性发生相对应的变化（Wang et al. 2011,2014）。2015年山西省农业厅统计,山西省苹果树栽培面积为33.40万公顷、梨树栽培面积为9.51万公顷,各个苹果树种植区均分布有一定面积的梨树（图3B）。本研究发现在忻州朔州地区苹果树种植面积与梨树种植面积的比例为1.12:1.94（图3B）;且当地普遍存在苹果树和梨树混栽的种植模式,V. pyri为晋北地区苹果树腐烂病致病菌、相对频率为100%。国内外学者研究表明V. pyri即可以侵染梨树又可以侵染苹果树,但是V. mali对苹果树的致病性要强于V. pyri（Wang et al. 2011,2014;臧睿 2012;臧睿等2007）。由此可见,山西省果区独特的种植结构及V. mali和V. pyri的2个种致病力的差异是造成山西省苹果树腐烂病菌群体与国内其他省份腐烂病菌群体存在差异的原因之一。

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基金

山西省重点研发计划项目（农业方面,201603D221013-3）

山西省农业科学院博士基金项目（YBSJJ1408）

山西省农业科学院重点项目（YZD1502）

山西省农业科学院科技攻关项目（2013GG46）

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摘要
Abstract
关键词
Key words
引用本文
1 材料与方法
1.1 病原菌采集与分离
表1 供试腐烂病菌菌株编号及来源
1.2 形态学观察
1.3 DNA提取及PCR扩增
1.4 系统发育分析
表2 23株山西省苹果树腐烂病菌的rDNA-ITS和EF1α的GenBank登入号
1.5 数据分析
2 结果与分析
2.1 病原菌菌落形态学特征
图1 山西省苹果树腐烂病菌菌落形态特征 A：JC206;B：JZ144;C：JZ159;D：CZ190;E：JZ120;F：TY130;G：SZ211;H：YC046.
2.2 系统发育分析
图2 苹果树腐烂病菌系统发育树
2.3 山西省各个苹果树种植区腐烂病菌的组成与分布
图3 山西省各个苹果树种植区腐烂病菌的组成与分布 A：山西省各个苹果树种植区腐烂病菌的百分比;B：山西省苹果树和梨树种植面积.
2.4 山西省各个苹果树种植区腐烂病菌种群结构聚类分析
图4 山西省8个苹果树种植区腐烂病菌相对频率的聚类分析图
3 结论
参考文献
基金

收稿日期	接受日期	出版日期
2015-05-31	2016-09-02	2016-12-22
发布日期
2016-12-22

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