刘晴
LIU Qing
通讯作者:
收稿日期: 2018-02-12
接受日期: 2018-03-2
网络出版日期: 2018-08-22
版权声明: 2018 中国科学院微生物研究所《菌物学报》编辑部 版权所有
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摘要
蛹虫草已经成为我国乃至东南亚地区极其重要的食药用真菌,虽然其子实体已经实现规模化生产,但在产业发展中遇到许多问题,真菌病害为其中之一,如引起蛹虫草“白毛病”病害的虫草生齿梗孢Calcarisporium cordycipiticola。本研究以虫草生齿梗孢为对象,研究了其生物学特性、发病特性及侵染特点。结果表明：该病原菌菌丝分枝较多,短时间内产生大量分生孢子;最适生长温度为25℃,此温度有利于该病害快速传播;其分生孢子比蛹虫草分生孢子耐紫外能力强。栽培过程中该病害多发生在蛹虫草生长发育后期,可以侵染培养基表面、子实体底部、中部和顶端等各个部位。人工接种发现该病原菌可以侵染蛹虫草生长发育的任意阶段,后期子实体被白毛覆盖。对峙实验发现虫草生齿梗孢菌丝逐渐生长到蛹虫草菌丝上,但未发现两菌丝互相缠绕的现象。对该病原菌基本生物学研究,将为建立该病害的早期检测及预防方法提供依据。
关键词：
Abstract
Cordyceps militaris has become one of the well-known edible and medicinal fungi in China and Southeast Asia. Although the fungus has been successfully cultivated and commercialized, it has encountered many problems in industrialized production, e.g. fungal disease caused by Calcarisporium cordycipiticola. In this study, the biological characteristics, pathogenicity and infection characteristics of this parasite were investigated. It was found that the branchy mycelia could produce a large number of conidia in a short time. The optimum growth temperature was 25°C, favouring the rapid spread of the disease. The conidia of the pathogen were more resistant to UV than those of C. militaris. The disease occurs in the later stage of the growth and development of C. militaris, and it can infect the surface of the cultures, and the bottom, middle and top of the fruiting bodies. Inoculation of conidia revealed that the pathogen could infect C. militaris at any stage of growth. Co-cultivation test indicated that C. cordycipiticola could gradually grow onto the mycelium surface of C. militaris. However, intertwinement of the mycelia of both species was not found. This study provides a reference for early detection and prevention of this disease during mass production of C. militaris.
Keywords：
蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Fr.又名北虫草或北冬虫夏草,隶属于子囊菌门Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、虫草科Cordycipitaceae、虫草属Cordyceps,是虫草属的模式种,该种也是子囊菌中重要的食药用真菌（戴玉成和杨祝良 2008;戴玉成等 2010）,已经实现大规模人工栽培。蛹虫草可以产生多种代谢产物,如类胡萝卜素、腺苷、虫草素、虫草酸、N6-(2-羟乙基)腺苷等（Zhou et al. 2009）;具有多种生物学活性,如抗肿瘤（Liu et al. 2017）、抗流感病毒（Lee et al. 2014）、防辐射（Jeong et al. 2014）、抗炎症等（Yoon et al. 2015;Chiu et al. 2016）。2009年中华人民共和国卫生部批准其为新食品原料,目前已成为我国乃至东南亚地区极其重要的食药用真菌,据估计我国蛹虫草产业年产值达100亿人民币（董彩虹等 2016）。
蛹虫草子实体已实现规模化生产,但在产业发展中遇到许多问题,如菇农称为“白毛病”、“吃草病”或“白腐病”的真菌病害。据调查,该病害占蛹虫草病害的90%以上,尤其是夏季高温高湿季节大范围发生,造成子实体产量降低。本课题组前期研究对其病原菌进行了分离,以新种虫草生齿梗孢Calcarisporium cordycipiticola Jing Z. Sun, Cai H. Dong, Xing Z. Liu and K.D. Hyde发表（Sun et al. 2016）,同时也有研究对此病害进行了报道（张园园 2016）。
C. cordycipiticola在蛹虫草子实体上形成白色菌落,覆盖于子实体表面,影响子实体发育,后期甚至导致子实体倒伏。据调查,病原菌C. cordycipiticola不仅造成蛹虫草子实体产量减少（Sun et al. 2016;张园园2016）,而且由于缺乏预防和防治措施,染病后菇农盲目用药造成子实体农药残留,严重影响蛹虫草产业发展。研究该病原真菌的生物学特性,将为该病害的控制及预防提供理论依据,促进蛹虫草产业健康发展。
1.1.1 供试菌株：从栽培染病的蛹虫草子实体中,分离纯化得到白毛病病原菌菌株,经形态学及分子系统学鉴定为Calcarisporium cordycipiticola,菌株在中国普通微生物菌种保藏中心（China General Microbiological Culture Collection Center）保存,保藏号为CGMCC 5.2193。
1.1.2 培养基及培养条件：蛹虫草子实体栽培采用常规方法（Guo et al. 2016）,C. cordycipiticola培养采用PDA培养基。
接种针刮取PDA平板上生长的C. cordycipiticola菌丝,放入1mL无菌水EP管中,涡旋振荡5min,使孢子充分分散在无菌水中,稀释至(1-2)×104个/mL,取100µL涂布于水琼脂平板,置于25℃培养,分别于12、24、36、72、120h观察单孢萌发全过程。
C. cordycipiticola孢子计数,稀释至3×102个/mL,取100µL涂布于PDA平板,分别置于4、10、15、20、25、30℃恒温培养15d,计算各温度下单孢萌发率及生长速率（mm/d）,每个温度4个重复;取100µL涂布于PDA平板,分别置于白光（630lux）、蓝光（13.2lux）、绿光（172lux）、红光（126lux）、粉光（330lux）（12h光照/12h黑暗）,25℃培养15d,完全黑暗作为对照,观察各光照下孢子萌发率及生长速度。
取200µL稀释至3×103个/mL孢子涂布于PDA平板,开盖置于紫外灯下照射（距离紫外灯60cm、94lux）,设置紫外照射时间为0、0.5、1、3、5、7、10min,每个条件4个重复。然后置于25℃恒温光照培养箱培养5d,观察紫外照射平板中孢子萌发情况并进行记录,蛹虫草分生孢子作为对照。
对栽培过程中受到C. cordycipiticola侵染的蛹虫草子实体进行跟踪观察,观察侵染全过程,跟踪记录60d。
模拟自然状态,在蛹虫草子实体生长发育的不同阶段（与蛹虫草混合接种、原基分化、子实体1cm、4cm左右）分别接种C. cordycipiticola,观察其发病全过程,跟踪记录60d。将被C. cordycipiticola菌株侵染的蛹虫草子实体进行显微观察,并剖开发病子实体,观察内部变化。
将虫草生齿梗孢和蛹虫草菌接种在同一个PDA平板,两者控制在合适的距离（2cm左右）,置于25℃恒温培养箱黑暗培养12d后见光培养2d,挑取两菌丝接触位置进行显微观察,观察两菌丝之间的相互作用。
在谷物培养基虫草和蚕蛹虫草栽培中均出现该病害（图1A,1B）,在蛹虫草子实体表面形成白色毛状物,覆盖子实体（图1C）,并产生大量分生孢子（图1D）,染病蛹虫草子实体内部发黑（图1E）。从染病子实体中,分离纯化得到蛹虫草白毛病病原菌虫草生齿梗孢C. cordycipiticola（图1F）。
图1 虫草生齿梗孢Calcarisporium cordycipiticola的分离及其形态观察
A-E：虫草生齿梗孢侵染的蛹虫草子实体;F：虫草生齿梗孢菌落;G-O：分生孢子及分生孢子梗. 标尺：C=400µm;D=200µm;G-O=10µm
Fig. 1 Morphology of Calcarisporium cordycipiticola.
A-E: C. cordycipiticola on a fruiting body of Cordyceps militaris; F: Colony of C. cordycipiticola; G-O: Conidiophore and conidia. Scale bars: C=400µm; D=200µm; G-O=10µm.
C. cordycipiticola菌丝分枝形成分生孢子梗,分生孢子梗上的孢子单生或簇生,一个分生孢子梗上着生1-6个孢子,大小为2.5-8.25×1.1-3.5µm,孢子形态多样,大部分为椭圆形,少部分为梭形、圆形、纺锤形、棒状、瓜子状、葫芦状（图1G-O）。
C. cordycipiticola单孢在水琼脂平板上12h左右开始萌发,萌发始于分生孢子两端,一端先萌发（图2A）,另一端再萌发。萌发后两端菌丝延长（图2B）,随后菌丝边延长边分枝（图2C,2D）,菌丝生长到一定阶段后,在最末端分枝形成分生孢子梗,分生孢子顶生或侧生（图2E）。在水琼脂平板上,单孢萌发出现肉眼可见的菌落一般需要4-5d（25℃）,且出现肉眼可见菌落即产生新的分生孢子（图2E）。
图2 虫草生齿梗孢孢子萌发过程
A：12h;B：24h;C：36h;D：72h;E：120h. 标尺：A-E=10µm
Fig. 2 Conidial germination of Calcarisporium cordycipiticola.
A: 12h; B: 24h; C: 36h; D: 72h; E: 120h. Scale bars: A-E=10µm.
虫草生齿梗孢分生孢子在0、10、15、20、25、30℃条件下培养16d,10、15、20、25℃可以萌发,4和30℃不萌发（图3A-F）,就生长速度而言,25℃最快,4℃、30℃培养不萌发的平板转入25℃继续培养10d,4℃可以萌发生长,而30℃不萌发（图3G,3H）。
图3 温度对虫草生齿梗孢孢子萌发和生长的影响
A-F：4,10,15,20,25和30℃;G,H：A,F重新放置25℃培养10d. 标尺：A-H=1cm
Fig. 3 Effects of different temperature on the germination and growth of Calcarisporium cordycipiticola.
A-F: 4, 10, 15, 20, 25, 30°C; G, H: Cultures of A and F being postponed for 10d at 25°C. Scale bars: A-H=1cm.
虫草生齿梗孢菌株在白光、蓝光、绿光、红光、粉光（12h光照/12h黑暗）、完全黑暗条件下,单孢生长速率、萌发率、菌落形态无差别,光照不影响该菌株的生长（表1）。
表1 虫草生齿梗孢不同光照下孢子萌发率与生长速率
Table 1 The germination and growth rates of Calcarisporium cordycipiticola under different light conditions
| 光照 Light | 萌发率 Germination rate (%) | 生长速率 Growth rate (mm/d) |
|---|---|---|
| 黑暗Dark | 75.83±4.19 | 0.99±0.03 |
| 白光White | 68.33±11.06 | 0.98±0.01 |
| 红光Red | 77.50±14.50 | 1.03±0.03 |
| 绿光Green | 72.50±13.16 | 1.04±0.03 |
| 粉光Pink | 78.33±20.82 | 1.00±0.04 |
| 蓝光Blue | 73.33±13.61 | 0.99±0.06 |
虫草生齿梗孢紫外照射3min后,置于25℃培养,孢子完全不萌发。紫外照射30s存活率为86%（图4）;相同条件下,蛹虫草紫外照射30s后孢子完全不能萌发。表明虫草生齿梗孢分生孢子比蛹虫草分生孢子更耐紫外辐射。
图4 紫外照射对虫草生齿梗孢孢子萌发的影响
标尺=1cm
Fig. 4 Effects of ultraviolet radiation on the spore germination of Calcarisporium cordycipiticola.
Scale bars=1cm.
通过对染病蛹虫草子实体追踪观察,发现在谷物培养基和蚕蛹虫草中虫草生齿梗孢侵染均主要发生在子实体生长发育后期,可以侵染培养基表面、子实体底部、中部和顶端等各个部位,但是以侵染子实体底部概率最高（图5A-F）。侵染前期子实体出现白色毛状物,随后侵染范围扩大（图6A-C）,且一旦染病常会导致产量大幅度降低,甚至绝产。
图5 虫草生齿梗孢侵染蛹虫草子实体任意部位
A-C：蚕蛹栽培;D-F：小麦培养基栽培
Fig. 5 Infection of Calcarisporium cordycipiticola at different parts of fruiting bodies of Cordyceps militaris.
A-C: Cultivation in silkworm chrysalis; D-F: Cultivation on wheat medium.
图6 虫草生齿梗孢自然与人工接种侵染蛹虫草过程观察
A-C：自然侵染过程;D-G：人工接种侵染过程
Fig. 6 Process of Calcarisporium cordycipiticola infecting Cordyceps militaris.
A-C: Natural infection; D-G: Infected by injecting the conidia of C. cordycipiticola.
人工接种虫草生齿梗孢分生孢子侵染发现其与自然侵染状态一致,子实体出现白色毛状物,随后侵染范围变大,后期子实体完全被虫草生齿梗孢菌丝覆盖（图6D-G）。
虫草生齿梗孢与蛹虫草菌1:1混合接种小麦培养基,在发菌阶段蛹虫草菌被该菌株完全覆盖,不能分化产生原基形成子实体;分别在原基分化、子实体1cm左右、4cm左右接种,均可侵染蛹虫草,最后子实体被虫草生齿梗孢完全覆盖（图7）。虫草生齿梗孢可以侵染蛹虫草子实体生长发育任意阶段。
图7 虫草生齿梗孢侵染蛹虫草子实体发育的不同阶段
A：在蛹虫草不同生长发育阶段接种C. cordycipiticola;B：接种蛹虫草菌种40d后蛹虫草子实体形态
Fig.7 Infection of Calcarisporium cordycipiticola at different development stages of Cordyceps militaris.
A: Inoculation of C. cordycipiticola at different development stages of Cordyceps militaris; B: Morphology of the fruiting bodies of Cordyceps militaris after being inoculated for 40d.
对虫草生齿梗孢侵染的蛹虫草子实体进行观察,发现虫草生齿梗孢菌丝完全覆盖子实体,目前未观察到白色的虫草生齿梗孢菌丝侵入蛹虫草子实体内部（图8）。
图8 虫草生齿梗孢侵染的蛹虫草子实体
A,B：被病原菌覆盖的蛹虫草子实体;C：被侵染的蛹虫草子实体剖面. 标尺：B=200µm;C=400µm
Fig. 8 The fruiting bodies of Cordyceps militaris infected by Calcarisporium cordycipiticola.
A, B: The fruiting bodies were covered by C. cordycipicola mycelia; C: The section of fruiting bodies of Cordyceps militaris. Scale bars: B=200µm; C=400µm.
将虫草生齿梗孢与蛹虫草菌株对峙培养（图9）,在两菌株接触位置（图9C）发现虫草生齿梗孢菌丝可以逐渐生长到蛹虫草菌丝上,导致黄色的蛹虫草菌丝变白。对两菌株接触位置进行显微观察,蛹虫草菌丝与虫草生齿梗孢菌丝直径基本一致,但蛹虫草菌丝分枝少（图9G,9J）、虫草生齿梗孢菌丝分枝较多（图9I,9L）;两菌丝交接处虫草生齿梗孢覆盖蛹虫草菌丝,但未发现该病原菌菌丝缠绕或侵入蛹虫草菌丝的现象（图9H,9K）。
图9 蛹虫草与虫草生齿梗孢平板对峙培养观察
A-C：平板正面;D-F：平板背面;A,D：蛹虫草菌;B,E：C. cordycipiticola;C,F：蛹虫草菌和C. cordycipiticola对峙培养;G,J：蛹虫草菌丝体;H,K：蛹虫草和C. cordycipiticola接触处菌丝体;I,L：C. cordycipiticola菌丝体. 标尺：G-I=200µm;J-L=20µm. 箭头所示分别为蛹虫草菌和C. cordycipicola菌丝
Fig. 9 Dual culture of Cordyceps militaris and Calcarisporium cordycipiticola.
A-C: Obverse side of Petri dish; D-F: Reverse side of Petri dish; A, D: Cordyceps militaris; B, E: C. cordycipiticola; C, F: Dual culture of Cordyceps militaris and C. cordycipiticola; G, J: Mycelium of Cordyceps militaris; H, K: Mycelium of Cordyceps militaris and C. cordycipiticola; I, L: Mycelium of C. cordycipiticola. Scale bars: G-I=200µm; J-L=20µm. Arrows indicate mycelium of Cordyceps militaris and C. cordycipicola.
具有抗癌活性的虫草素（cordycepin）和喷司他丁（pentostatin）合成途径的解析（Xia et al. 2017）让蛹虫草再次成为研究和开发的焦点。然而,产业发展中依然面临许多问题,真菌病害为其中之一。白毛病病害不仅造成蛹虫草产量降低,更重要的是由此可能引发的农药污染、子实体产品安全问题。本研究通过对蛹虫草白毛病病原菌虫草生齿梗孢C. cordycipiticola形态观察、生长特性、染病特点等进行研究,将为该病害的控制及预防提供理论依据。
Sun et al.（2016）在报道新种时,发现虫草生齿梗孢菌株极易产孢子,每个分生孢子梗着生1-3个分生孢子。本实验的观察发现该菌菌丝分枝较多,在每个分枝的末端一般都能形成分生孢子梗,且一个分生孢子梗产生1-6个分生孢子,分生孢子形态多样。该菌株可能依靠产生大量分生孢子进行快速传播。
蛹虫草的最适生长温度为20℃,而本研究表明虫草生齿梗孢菌株最适生长温度为25℃,两者之间差异明显,这也是栽培生产中该病多发生于高温季节的原因。光照对该菌株孢子萌发和生长无影响,光照菌丝不转色,分生孢子耐紫外照射能力强于蛹虫草分生孢子,因此,可以利用严格的温度调控对该病的发病率进行控制。
张园园（2016）报道,该病害发病初期,培养基表面有白色菌丝;随后病原菌菌丝蔓延至蛹虫草子座;发病后期,白色菌丝吞噬蛹虫草子座,导致子座倒伏。我们通过对发病过程的大量观察发现,该病可以出现在培养基表面,也可以在子实体底端、中部、顶端等不同部位;人工接种试验发现该病原菌可以侵染蛹虫草的不同生长发育阶段。
早在两百多年前,真菌学家们就发现真菌中的某些种类可以生长或者寄生在其他真菌上（Cook & Baker 1983;庄文颖 1991）,菌生真菌（fungicolous fungi）既包括寄生的种类也包括非寄生的类群,菌生真菌与寄主或基物真菌并不都是寄生与被寄生的关系（庄文颖 1991）。对于菌寄生真菌而言,与寄主接触并识别,识别后产生不同的侵染结构,如附着胞、菌丝卷和钩状体。最后,以机械侵入的方式或分泌胞外水解酶侵入寄主细胞内,吸收营养并导致寄主细胞畸变甚至溶解（林超等 2005）。本实验对于两菌株菌丝相互作用的观察未发现该病原菌产生侵染结构,也没有观察到缠绕蛹虫草菌丝的情况;将被感染的蛹虫草子实体剖开,发现其子实体内部颜色加深,可能有未知的代谢产物产生。本研究观察表明C. cordycipiticola在活体蛹虫草上生长,但是其是否为蛹虫草的寄生菌（mycoparasite）,还需要进一步深入研究虫草生齿梗孢及其与基物真菌蛹虫草菌之间的相互作用。本实验室正在建立虫草生齿梗孢的转化体系,采用绿色荧光蛋白GFP（green fluorescent protein）进行标记,以研究其侵染过程和相互作用的方式。
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