块菌属Tuber是一类珍贵的地下生外生菌根食药用真菌,具有重要的经济和生态价值。分子生物学技术的快速发展尤其是高通量测序技术在块菌属研究领域的应用,极大地推动了块菌属分类、系统学、生态、生化、菌根共生机制及人工种植等研究。本文重点从块菌的分子系统学、群体遗传学及菌根共生机制3个方面对近5年的研究成果进行综述,并对其研究和应用前景进行了展望。
从广西和海南植物根系采集的土样经用头发富集后分离获得3株赛多孢菌株G79、EM65901和EM65901.2,采用系统发育和单倍型网络并结合形态特征对其分类地位进行确证,G79菌株提议为新种少孢赛多孢,其典型特征是：分生孢子顶生或侧生于菌丝上,产孢较少,孢子透明至半透明,倒卵形,5.4-10.8×3.2-5.4µm,无间生孢子和厚垣孢子;EM65901和EM65901.2两菌株为另一新种,定名为三亚赛多孢,其典型特征是：分生孢子顶生或侧生于菌丝或支撑细胞上,单生或1-4个着生于膨大或不膨大的支撑细胞上,透明至半透明,倒卵圆形,4-7.5×3-4µm,少数近球形,3-5µm,无间生孢子;厚垣孢子椭圆形,5-7.5×4-6.5µm,或近球形,5-7.5µm。
本研究对贵州地区茯砖茶中的“金花菌”进行了分离鉴定。通过PCR扩增及测序技术获得转录间隔区序列及部分核糖体大亚基（ITS+LSU）、β-微管蛋白（β-tubulin）、钙调蛋白（CaM）和RNA聚合酶Ⅱ（RPB2）4个基因的序列,然后构建多基因系统树,并对其形态特征进行观察,将其鉴定为冠突曲霉Aspergillus cristatus。
对于野生植物根内定殖的丛枝菌根真菌（AMF）和暗隔内生真菌（DSE）多样性及其生态功能现已进行了众多的调查研究。然而,对于同时定殖于栽培作物同一根系的这两种真菌的物种多样性和功能了解甚少。本研究旨在采用传统的形态学方法和PCR-DGGE技术探究保护地栽培的黄瓜Cucumis sativus Linn.根内AMF和DSE的物种多样性。PCR-DGGE结果显示共有7种AMF,包括Funneliformis mosseae,Glomus fasciculatum,Glomus indicum,Scutellospora dipurpurescens,Gigaspora margarita以及2个未培养的Archaeospora;而以黄瓜植株根段作为接种物加富培养后,依据其所产生的孢子形态特征进行分类鉴定,则只分离获得3种,即F. mosseae,G. indicum 和Gi. Margarita;同时,采用常规分离纯化的方法从黄瓜根内分离得到DSE 6个菌株,其中1株经分子生物学鉴定为Phoma leveillei。从保护地根区土壤中分离AMF孢子并通过形态学分类鉴定,获得了9属20种。研究结果表明,Glomus是保护地栽培黄瓜根系内的优势属,针对数量,相对于传统形态鉴定技术,分子技术可以检测到根内更多的AMF。
采用过滤涂皿的方法对云南程海湖冬季湖水样品中的酵母菌进行分离,通过26S rDNA D1/D2区域序列分析并结合形态观察和生理生化测试对分离获得的菌株进行鉴定,同时采用胞外酶定性筛选培养基进行产酶活性筛选,分析冬季程海湖酵母菌的多样性及胞外酶活性。结果从程海湖中分离获得171株酵母菌,鉴定为14个属22个种和2个潜在的新分类单元;优势属是红冬孢酵母属Rhodosporidium、红酵母属Rhodotorula和隐球酵母属Cryptococcus;优势种是红冬孢酵母Rhodosporidium kratochvilovae和斯鲁菲亚红酵母Rhodotorula slooffiae;湖北半部的样点CH2的多样性指数（H′=1.5945）和丰富度指数（R=2.7576）均最高,均匀度指数较高的是湖北部的样点CH1（J=0.8531）;样点之间种群差异大,相似性低。大多数酵母菌株具有产1种以上的胞外酶。
本文通过共培养试验、菌剂盆栽试验和田间小区试验研究了烟草内生真菌对烟苗生长和烟叶重金属含量的影响。结果表明：在199株烟草内生真菌中,镰刀菌菌株YCEF005和棘壳孢菌菌株YCEF053、YCEF191、YCEF193、YCEF199具有促进烟苗生长的作用,与内生真菌共培养的烟苗叶片数、根和地上部鲜重和干重均显著增加,YCEF005菌剂对盆栽烟草的生长促进作用最为显著。在Cd2+单一处理时,内生真菌YCEF005、YCEF053、YCEF191、YCEF193菌剂显著减少盆栽烟叶Cd含量25.87%-39.11%;在Cd2+、As3+、Pb2+混合处理时,内生真菌YCEF005、YCEF053、YCEF191、YCEF193菌剂显著减少盆栽烟叶Cd含量25.22%-50.56%、As含量22.10%-36.07%、Pb含量4.35%-47.01%;在田间小区试验中,采用YCEF005+YCEF053混合菌剂显著减少上部烟叶Pb含量18.66%、下部烟叶Cd含量22.41%。研究表明烟草内生真菌在促进烟草生长和减少烟叶重金属含量中具有一定的应用潜力。
双孢蘑菇是世界第一大宗栽培食用菌,具有重要经济价值。为探讨双孢蘑菇子实体不同发育时期基因表达变化,利用高通量测序技术对双孢蘑菇原基期、采收期和开伞后期等不同发育时期进行RNA-Seq分析,共筛选到6 328个差异表达基因,其中3 941个上调基因,2 387个下调基因。Gene Ontology（GO）功能聚类分析表明,差异表达基因主要富集在结合、催化分子功能组和代谢过程生物学通路中,且发育过程和有性繁殖相关的基因全部为上调表达,以利于细胞分化发育形成成熟子实体进入生殖生长阶段。KEGG功能富集分析结果表明,差异基因参与了氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂类代谢和能量代谢这五大代谢通路,其中差异基因主要富集在氨基酸代谢通路中,氨基酸合成相关的多数基因上调表达,表明双孢蘑菇子实体发育形成需要一系列代谢反应协同调控,氨基酸代谢相关基因可能在双孢蘑菇子实体发育过程中起重要作用。本文通过全面分析双孢蘑菇子实体发育时期基因表达变化,获得了大量转录本信息,为深入了解双孢蘑菇子实体发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。
组氨酸激酶是真菌感受外界刺激的重要组成部分,它使真菌能适应和应答环境的改变。通过RT-PCR克隆蝉棒束孢Isaria cicadae组氨酸激酶基因IcHK的ORF序列,对IcHK基因序列分析表明其翻译产物IcHK中存在着4个HAMP功能域、1个HisKA功能域、1个HATPase功能域和1个REC功能域。采用实时荧光定量PCR方法研究了3种杀菌剂咯菌腈（Fludioxonil）、异菌脲（Iprodione）和克菌丹（Captan）对蛹虫草Cordyceps militaris组氨酸激酶CmHK和蝉棒束孢组氨酸激酶IcHK表达的影响。结果表明,CmHK基因的表达对这3种杀菌剂的影响不敏感,这3种杀菌剂不能导致CmHK基因的相对转录量明显增加。IcHK基因的表达对这3种杀菌剂的影响都敏感,特别是对咯菌腈和克菌丹更为敏感,这3种杀菌剂可导致IcHK基因的相对转录量的增加。研究结果表明不同真菌应对相同胁迫环境时,同源基因的表达特征可存在差异。
从北京西郊森林土壤中分离到产生糖化生淀粉的葡糖化酶的特异腐质霉Humicola insolens HG-618菌株。优化的产酶培养基如下：6%麦麸、2%玉米粉、0.7%磷酸氢二铵和1%玉米浆,pH 8.0,250mL三角瓶装40mL培养基,在40℃和280r/min培养90h。以生玉米淀粉为底物,发酵液中葡糖化酶活力为180U/mL。酶学性质试验表明,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为65℃;在pH 6.0-9.0范围酶活力稳定;酶热稳定性强,在60℃和pH 6.0保温8h,酶活力仍保留83%。一步糖化生玉米粉试验表明,在50mL 30%浓度生玉米粉浆和270U HG-618葡糖化酶的反应体系中,采用自然pH 6.7,在55℃和100r/min条件下糖化40h。获得的糖化液还原糖浓度为17.1%（由酶产生的还原糖浓度为15.9%）,生玉米粉中所含淀粉的糖化率为90%,且产生的糖全部为葡萄糖。因此,该葡糖化酶具有良好的一步糖化生玉米粉前景,它也可以用于生大米粉、生小麦粉和生马铃薯粉的直接糖化。
灵芝多糖和三萜是灵芝主要的药理活性物质。如何提高液体发酵中灵芝多糖和三萜的含量是目前研究的热点。本研究以J-7/AL-2菌株为例,在灵芝的液体发酵中加入10mmol/L钙离子诱导,多糖含量比对照提高34%,三萜含量提高64%。在发酵液中加入150µmol/L水杨酸（SA）诱导,多糖含量提高57.54%,三萜含量提高37.19%。在灵芝的液体发酵第12天加入10mmol/L钙离子和150µmol/L水杨酸,三萜含量提高46.9%。在不同诱导条件下,三萜的高效液相图谱（HPLC）显示钙离子与对照的差异性比较大。灵芝三萜关键酶基因的表达也有所不同。水杨酸提高法尼基焦磷酸合酶（FPS）、鲨烯合酶（SQS）和羊毛兹醇合酶（LS）基因的表达量,而钙离子和钙离子与水杨酸共同处理提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转录水平还原酶（HMGR）、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（MVD）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）、鲨烯合酶（SQS）和羊毛兹醇合酶（LS）6个三萜关键酶基因的表达量。在3种处理下,都是SQS的基因表达量提高最多,推测SQS基因是灵芝三萜合成过程中重要的基因。
槐生多年卧孔菌Perenniporia robiniophila、微酸多年卧孔菌Perenniporia subacida和白蜡多年卧孔菌Perenniporia fraxinea均属于药用真菌,具有较高的应用价值。本研究将这3种药用真菌进行液体培养,测定此过程中的漆酶活性、多酚含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）、过氧化氢酶（catalase,CAT）活性、抑制羟自由基能力（restraining ability to hydroxyl free radicals,RAHFR）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力。结果显示,所选取的3种多年卧孔菌均具有抗氧化活性,且该活性与菌株自身的生长状况、次级代谢产物分泌及降解酶活性等密切相关。其中,微酸多年卧孔菌分泌的漆酶活性最高,出现峰值时间最早,第6天时酶活可达2.51U/mL。槐生多年卧孔菌在液体培养过程中分泌多酚、T-AOC和CAT的能力最强,于第2天、第12天和第8天时分别达1.54mg/mL、2.59U/mL和7.71U/mL。此外,该菌株对羟自由基及DPPH自由基的清除能力也较强,在第10天和第2天分别为78.42U/mL和26.65%。而白蜡多年卧孔菌仅分泌SOD的能力最强,第2天时酶活为1.87U/mL。相比之下,3种多年卧孔菌中尤其以槐生多年卧孔菌的抗氧化活性最高,微酸多年卧孔菌次之,最后是白蜡多年卧孔菌。
本文探讨了蛹虫草多糖对急性酒精性肝损伤小鼠模型的影响,并对蛹虫草多糖相对分子质量和单糖组分进行了分析。以12.86mL/kg BW的剂量一次性灌胃50%乙醇诱导小鼠产生急性酒精性肝损伤模型,灌胃蛹虫草多糖,结果表明蛹虫草多糖可以显著降低急性酒精性肝损伤后小鼠肝匀浆中的过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）的含量（P<0.01）;提高肝匀浆中的还原型谷胱甘肽（GSH）的含量（P<0.01）;脂肪变性程度均低于阳性对照组（P<0.01）。采用凝胶过滤法测定蛹虫草多糖的相对分子质量为117kDa;高效气相色谱结果分析表明蛹虫草多糖是由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的,其组成比例分别为鼠李糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1:2.39:5.40:30.67:13.37。
在形态学研究和分子系统发育分析的基础上,本文报道了丝盖伞属丝盖伞亚属3个中国新记录种,分别为垂暮丝盖伞Inocybe appendiculata、薄囊丝盖伞I. leptocystis和华美丝盖伞I. splendens。根据国内采集的材料对此3种进行了描述和绘图。通过对馆藏标本的查阅给出了它们已知的国内地理分布。对丝盖伞亚属国内已证实有分布的28个分类群编制了分种检索表。
为认识喀斯特山地适应竹种小蓬竹根际土壤微生物多样性,本文采用稀释平板法研究小蓬竹根际土壤真菌多样性。结果表明,菌落具有表型差异的真菌共33株,rDNA-ITS进行BLAST划分为12个属24个种,相似度为75%-100%。子囊菌门真菌11个属、23个种、32株;担子菌门仅有1株,属多年卧孔菌属。子囊菌门的青霉属的菌株数量最多,占总菌株数21.21%。小蓬竹根际真菌数量为9.19×105/cfu·g,Shannon-Wiener多样性指数H为2.2180,Margalef丰富度指数R为12,Pielou均匀度指数J为0.8926。
通过菌丝生长抑制方法测定枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis EDR4对灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的抑制作用,利用电子显微镜观察受到抑制的灰葡萄孢菌丝形态和细胞结构的变化。结果表明,菌丝生长异常,分支变多,出现不规则膨大和缢缩;线粒体数量异常增多并出现不规则肿胀;细胞质外渗,出现空腔化细胞;细胞器泡囊化解体和细胞崩解,细胞趋于死亡。
