药用植物内生真菌普遍存在于健康植物组织和器官中,种类繁多,分布广泛。到目前为止,人们已从大量药用植物中分离出不同类型的内生真菌,这些植物广泛分布于除南极洲以外的各种陆地生态系统中。随着现代科学技术的迅速发展,药用植物内生真菌的研究也取得了长足的进步。由于内生真菌对于药用植物的重要性,其相关研究也受到了世界各国学者的高度关注。本文总结现阶段药用植物内生真菌相关研究,并对未来研究的发展趋势做出展望。
内生真菌与药用植物在长期的协同进化过程中形成了特殊的互惠共生关系,内生真菌在药用植物的生长、道地性、产量、质量、功效成分、抗逆性等方面都产生重要的影响;另一方面,药用植物内生真菌自身也能产生一些生理活性物质,在新药研发、药用植物栽培生产、菌肥开发、生防菌研发、土壤生态修复、工业化酶生产应用等方面都显示出巨大的开发潜力。我国药用植物资源丰富,其中更是蕴含着许多还不为人知的内生真菌类群,这一资源宝库亟待人们探索、开发。
兰科植物种子细小,无胚乳,自然条件下需与适宜的内生真菌共生才能萌发。近年来,大量研究结果表明,内生真菌能够为兰科药用植物种子萌发提供必要的碳源、氮源等多种营养物质。本文对内生真菌为兰科药用植物种子提供的营养物质进行总结,并对二者的营养关系进行了综述。
手参Gymnadenia conopsea是一种地生兰科植物,也是中国传统中药材之一。研究以ITS1为目标序列,应用 Illumina MiSeq高通量测序技术对北京地区松山和百花山的手参内生真菌区系组成进行测定分析。结果表明,从手参的根中获得有效序列50 420条,209个可操作分类单元（OTUs）,分属于3门9纲28目54科,包括盘菌纲Pezizomycetes（3个OTU）、伞菌纲Agaricomycetes（21个OTU）、锤舌菌纲Leotiomycetes（18个OTU）、粪壳菌纲Sordariomycetes（51个OTU）、接合菌纲Zygomycetes（18个OTU）、银耳纲Tremellomycetes（19个OTU）、散囊菌纲Eurotiomycetes（22个OTU）、酵母纲Saccharomycetes（8个OTU）、座囊菌纲Dothideomycetes（14个OTU）。其中,百花山手参根中内生真菌优势类群是鸡油菌目Cantharellales（38.62%）和柔膜菌目Helotiales（24.64%）真菌;松山手参的优势内生菌类群是盘菌目Pezizales（66.19%）和鸡油菌目Cantharellales（29.75%）真菌。这些结果利于系统了解手参根部内生真菌区系组成以及优势内生真菌类群,为今后开展相关内生真菌在手参人工繁育中的应用奠定了基础。
为了解贵州省马比木内生真菌的多样性,通过采集贵阳修文、遵义播州、铜仁万山3个县区的不同季节的健康马比木植物不同组织部位样本进行内生真菌的分离,分析分离菌ITS rDNA序列,采用分子系统学方法,对3个地区的不同季节马比木植物不同组织部位的内生真菌进行鉴定、归类,并进行多样性评价。结果表明,从1 444个马比木组织块中分离出1 037株内生真菌,分别隶属于30个属,其中间壳座属Diaporthe为优势属,分离率与分离频率分别为40.24%与57.58%;夏季内生真菌的多样性指数最高,4个季节的相似度在0.40-0.71之间,贵阳的相似性指数最高,三地的相似性指数在0.42-0.55之间,果实的多样性指数最高,各个组织部位的相似性指数在0.00-0.54之间。表面植株生长环境及部位对内生真菌的组成和多样性均有影响。
天麻Gastrodia elata种子细小而无胚乳,自然条件下需要石斛小菇Mycena dendrobii等真菌共生来完成种子萌发和生长。为了探讨天麻种子接菌萌发过程中的基因表达变化,本研究利用高通量RNA测序技术,对共生真菌石斛小菇、天麻成熟种子以及接菌萌发后的天麻原球茎进行比较分析,共获得42 263条注释unigenes,并筛选到5 409条差异表达基因。GO分析表明,差异表达基因主要参与代谢、离子结合等生物学通路中。KEGG功能富集分析结果表明,差异基因参与了植物激素信号传导、碳代谢、苯丙素生物合成、淀粉与蔗糖代谢以及氨基酸生物合成中。真菌和植物细胞壁多糖经降解产生的寡糖激发子,可以诱导宿主产生多种防御反应,参与到宿主与真菌互作中。在共生萌发过程中,真菌细胞壁降解相关基因的表达显著提高,如几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表达甚至上调了20倍之多。此外,植物细胞壁木聚糖酶和果胶酶基因表达显著升高。这类基因表达可释放寡糖激发子,在天麻种子对石斛小菇的防御过程中起到重要的作用。本文全面分析天麻种子接菌萌发前后基因表达变化,为进一步研究天麻重要功能基因的功能鉴定提供基础。
天麻Gastrodia elata是典型的腐生型兰科药用植物,其种子萌发需要小菇属Mycena真菌的侵染和共生,目前天麻种子共生萌发分子机制是该领域的热点问题。我们首次对天麻种子共生萌发过程进行了系统的蛋白质组学研究。采用iTRAQ标记的液质联用技术,成功鉴定了天麻成熟种子和萌发后原球茎的蛋白质组,共鉴定蛋白1 769个（global FDR 1%）。两组进行了差异蛋白质组学研究,获得差异蛋白269个。差异蛋白GO注释结果表明,在天麻种子共生萌发过程中,差异蛋白参与的功能和生物过程多样,以催化和结合为主,还参与感知环境刺激、分子信号等功能。KEGG代谢通路分析表明,差异蛋白还主要参与了转导、能量代谢、次生代谢和环境适应等过程。我们发现,一些参与内吞作用的蛋白在共生萌发过程中存在差异表达,表明内吞可能参与到二者互作过程中。对差异蛋白质组的深入解析和研究有利于揭示天麻种子共生萌发的分子机制,具有较强的理论和现实意义。
本文对石斛内生炭角菌DNA提取方法进行优化,并基于ITS序列及其ITS2二级结构对其进行分子鉴定。比较试剂盒法及不同浓度（2%、3%、4%）CTAB法的DNA提取效果并对CTAB法进行优化;进行ITS序列的扩增及ITS2二级结构的预测。结果表明：4%的CTAB提取效果最佳,优化的CTAB法大大缩短了DNA提取时间;ITS序列与炭角菌属3个种的相似度均为99%,ITS2二级结构仅与Xylaria arbuscula的二级结构100%相似。本研究所优化的CTAB法能为后续相关研究提供便利;结合ITS序列及ITS2二级结构能对石斛内生炭角菌进行准确的分子鉴定。
本研究从陕西留坝紫柏山采集的七叶树Aesculus chinensis根和茎中分离出一株具有高产七叶皂苷C的内生真菌,将其编号为EA-LJS80。利用ITS序列分析鉴定其种属并对其形态进行观察;采用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描,确定其最大紫外吸收峰;采用HPLC测定七叶皂苷C的产量;采用滤纸片扩散法研究其发酵液提取物的抑菌活性;采用CCK-8法测定提纯后七叶皂苷对肺腺癌A549细胞的增殖抑制率,探究其生物活性。结果显示,该菌株EA-LJS80为曲霉菌属Aspergillus真菌,最大紫外吸收波长为230nm,测得提纯后七叶皂苷C的产量为9.23mg/mL。生物活性实验表明：菌株EA-LJS80的发酵液提取物对大肠杆菌Escherichia coli等4种致病菌有明显的抑菌效果;经CCK-8法测定,提纯后的七叶皂苷对肺腺癌A549细胞的增殖有明显的抑制作用。综上所述,菌株EA-LJS80具有产七叶皂苷活性,尤其是七叶皂苷C的产量较高,且其产生的七叶皂苷具有较高的生物活性,这对于改进七叶皂苷生产模式,提高生产效率具有重要意义,同时对于七叶皂苷C的进一步研究有一定的促进作用。
从荒漠药用植物沙蒿的内生真菌Embellisia chlamydospora中首次分离得到3种酚酸类化合物,分别为barceloneic acid A (1), barceloneic lactone (2), 2′-O-methyl-barceloneate (3)。根据其NMR与HR-ESI数据以及相关文献比对,确定了3个化合物的结构。活性试验结果证实化合物2和3显著抑制拟南芥根生长。目前,从E. chlamydospora真菌中仅分离出2种化合物terpestacin和embellistatin。本实验结果丰富了该真菌的化学成分多样性,进一步暗示特殊生境的植物内生真菌是产生结构新颖与活性显著的次级代谢产物的重要宝库。
本文介绍从药用植物丹参内生真菌中筛选新获得的一株对丹参生长和丹酚酸含量具有显著促进作用的菌株,Cladosporium sp. SM58。运用菌根生物技术,于离体、盆栽和田栽条件下,分别将丹参组培苗或幼苗接种SM58固体菌种后,观察测定菌株SM58对丹参组培苗生长的影响,以及丹参幼苗接菌培植6个月后菌株SM58对丹参丹酚酸有效成分含量和生物量的影响;同时进行显微观察,对菌株SM58侵入田栽丹参根组织的状况进行分析。结果表明,SM58菌株不仅对丹参组培苗的株高、根长和生物量均有显著促生长作用（P<0.01）,而且对盆栽和田栽丹参的丹酚酸有效成分含量和根干重的提高也均有显著效果（P<0.01）。与对照相比较,接菌组田栽丹参的根干重、总酚酸含量、丹酚酸A的含量分别提高68%、47%、11%。显微观察显示SM58菌丝主要通过侵染丹参的根表皮细胞和皮层细胞而对丹参产生影响。本研究表明,SM58菌株能对丹参品质和产量产生有益影响,是一株具有很好研究价值和开发应用的活性菌。
采用形态学及ITS-rDNA序列分析法,对具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的蛇足石杉内生菌株JR14进行鉴定,确定为无柄盘菌Pezicula sp.。开展了乙酰胆碱酯酶抑制活性化合物的分离,从Pezicula sp. JR14乙酸乙酯提取物中分离到4个化合物,利用核磁共振及质谱技术将其鉴定为behenic acid (1)、himeic acid B (2)、secalonic acid A (3)和palmitic acid (4)。采用改进的Ellman比色法对分离的化合物进行活性检测,结果表明,himeic acid B (2)具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其IC50为205μg/mL（0.64mmol/L）。
本文采用常规组织块分离法及直接克隆测序的方法初步鉴定了新疆天山地区代表性的两种药用植物天山雪莲和红景天根内可培养及不可培养的内生真菌。从两种药用植物根中共分离获得34株内生真菌,除7株鉴定为镰孢菌属Fusarium外,其余菌株均具有暗色、有隔菌丝,不产生孢子;从形态上看,属典型的深色有隔内生真菌（dark septate endophyte,DSE）。采用直接克隆测序的方法,从两种植物的根中共获得143个真菌克隆子。依据核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列鉴定多数克隆子归属于柔膜菌目Helotiales及格孢腔菌目Pleosporales,与已知的DSE如背芽突霉属Cadophora、瓶头霉属Phialocephala、瓶霉属Phialophora以及Leptodontidium等有90%以上的核苷酸序列相似性。该结果显示DSE在天山雪莲和红景天根部内生真菌中占优势,暗示其可能参与了宿主植物对高寒、强辐射环境的生态适应。
从红豆杉内生真菌青霉菌Penicillum sp. H⑥.1发酵产物中自然析出一种化合物,经图谱检测和文献比对,鉴定为震颤毒素Penitrem A。四唑盐（MTT）比色法研究表明Penitrem A对恶性黑色素瘤细胞A375有一定的抑制作用,且抑制作用随浓度的增大而增强,IC50为27.24μg/mL。本研究是首次从红豆杉内生真菌发酵产物中分离得到震颤毒素Penitrem A,为抗肿瘤药物开发提供了理论参考。
