大多数可栽培的食用菌是属于担子菌的大型真菌,具有复杂的交配型系统,通常涉及到两类交配型基因,即编码同源域转录因子的A交配型基因以及编码脂肽信息素和信息素受体的B交配型基因。对担子菌交配型系统的研究已经有上百年的历史,近年来随着高通量测序技术的发展,很多常见食用菌的基因组获得测序,使得我们对不同类型交配型位点的分子遗传学结构能够进行更加细致的解析。本文在概述了担子菌有性生殖系统和交配型基因分子特点的基础上,对常见食用菌中的香菇、金针菇、灵芝、糙皮侧耳、刺芹侧耳、白灵侧耳、裂褶菌、双孢蘑菇、草菇和虎皮香菇以及模式生物灰盖鬼伞等物种的交配型位点的结构进行了总结和分析。从已有的研究结果来看,常见食用菌的交配型位点的分子遗传学结构存在多样性,不同物种的交配型位点具有不同的结构特点。从物种内不同菌株之间的交配型结构比较来看,交配型基因的位置和数量也具有丰富的多样性。在分子遗传学层面对常见食用菌交配型位点结构的认识将有助于深入阐明交配型基因对子实体发育的调控以及解决食用菌生产实际中的科学问题,但是目前对食用菌交配型位点和基因的研究仍旧存在很多空白,有待于进一步深入和拓展。
代谢组学是利用现代分析化学手段对一定条件下生物体内小分子代谢产物（初级和次级代谢产物）定性及定量,从而揭示生命现象及其内在规律的学科。相对于基因组、转录组和蛋白质组,代谢组是一定条件下生物学过程完成后的最终代谢产物的集合,因而是各种组学研究中最接近表型的一种组学,可以直接动态地反映出细胞的生理生化过程,从而有效地检测和发现特定的生化途径,准确地解释生理或者病理现象。代谢组学作为系统生物学中基因组学、转录组学以及蛋白质组学三大组学的延伸和补充,是目前的研究热点之一。目前代谢组学在真菌领域的研究得到日益重视和发展。本文首先从历史发展和技术路线简述了代谢组学的发展历程和常见的代谢组学研究方法。接着从真菌的分类鉴定、生物膜研究、代谢途径、代谢工程、天然产物发现与植物互作这6个方面介绍了代谢组学在真菌研究领域的应用。
毒蘑菇似乎是一个永恒的话题：一方面毒蘑菇每年在世界范围内造成相当数量的人中毒甚至死亡事件;另一方面,毒蘑菇的价值也逐渐被认识,应用毒素进行癌症等疾病治疗的研究取得了重要成果。近年来,毒蘑菇的基因组等组学研究迅速升温,极大地促进了这一领域的研究,揭示了一些毒素的生源合成基因及合成机制,几种毒素合成的进化历史也日益清晰。本文总结了近10余年来毒蘑菇研究在基因组、转录组、蛋白组学等方面取得的最新研究进展,归纳了研究的主要方向和动态,并展望了未来的发展趋势。
烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草变种引起的一种对烟草生产造成巨大经济损失的土传病害。本文以健康烟株与感染黑胫病烟株茎秆和根际土壤为研究对象,通过PCR技术扩增样本中真菌转录间隔区的ITS1区域,采用Illumina Miseq高通量测序技术对扩增片段进行测序,旨在了解黑胫病感染对于烟草茎秆和根际土壤真菌群落结构与多样性的影响。本研究20个测序样品,共获得755 599条高质量序列片段,最短序列为200bp,最长序列为356bp,平均序列长度248bp。结果表明,健康烟株和发病烟株根际土壤的优势真菌为子囊菌门Ascomycota、接合菌门Zygomycota和担子菌门Basidiomycota,所有茎秆样品的优势真菌为子囊菌门、担子菌门。健康烟株与感染黑胫病烟株根际土壤样品相对丰度大于1%的属有镰刀菌属Fusarium、被孢霉属Mortierella、隐球菌属Cryptococcus、链格孢属Alternaria和赤霉菌属Gibberella等,其中,健康烟株根际土壤优势属为镰刀菌属（39.35%）和被孢霉属（14.19%）,发病烟株根际土壤镰刀菌属和被孢霉属相对丰度分别为40.26%和20.77%;健康茎秆样品优势属为隐球菌属（31.12%）、链格孢属（18.28%）、镰刀菌属（15.67%）和红酵母属Rhodotorula（13.34%）;病健交界茎秆样品优势属为镰刀菌属（41.36%）、隐球菌属（28.15%）和链格孢属（22.32%）;发病茎秆优势属为隐球菌属（62.14%）和链格孢属（27.75%）。烟株感染黑胫病后,其根际土壤与茎秆样品真菌优势属种类与健康烟株无明显变化,但属水平的相对丰度变化显著。发病烟株茎秆与根际土壤样品真菌群落Sobs、Chao1、Shannon指数较健康烟株降低,Simpson指数上升,表明烟株发病后根际土壤真菌与茎秆内生真菌群落丰富度与多样性降低。该结果对于研究烟草黑胫病发生的微生态机制及其生物防治具有一定的理论指导意义。
本研究通过Illumina MiSeq平台对邻近野生土壤（GL0）、种植1年（GL1）、2年（GL2）和4年（GL4）的灵芝覆土进行ITS1扩增子测序,分析灵芝连作覆土中真菌群落的变化,为揭示灵芝连作障碍的机理提供理论依据。研究结果表明,12个灵芝土壤样本一共获得349 642条有效序列,经聚类得到2 426个OTU,分别隶属于8门、28纲、64目、127科、233属和449种。在门水平上,随着连作年限的增加,灵芝覆土中真菌的多样性水平逐渐减低,在GL4组中只含有担子菌门（Basidiomycota,占85.03%）、子囊菌门（Ascomycota,占14.77%）和少量被孢霉门（Mortierellomycota,占0.20%）。其中,担子菌门的相对丰度随着连作年限的增加显著增加,子囊菌门的相对丰度显著减少,而被孢霉门的相对丰度无显著性差异。在属水平上,担子菌门灵芝属Ganoderma的相对丰度随着连作年限的增加而极显著增加,子囊菌门仅青霉属Penicillium菌群的相对丰度呈现先减少后增加的趋势,在GL4组中相对于GL0组其相对丰度增加了57.92%,表明青霉属可能是引发该地区灵芝连作障碍的重要菌群,该研究为探索灵芝连作障碍的分子机制和生态防控提供了理论依据。
本研究利用基于毛木耳全基因组开发的SSR标记对27份毛木耳菌株（野生14株、栽培13株）的遗传多样性进行分析。首先随机选取3个菌株（2个野生菌株、1个栽培菌株）的DNA为模板,从144对SSR引物中筛选出扩增条带清晰、稳定性强、多态性丰富的引物24对。24对SSR引物共检测到116个多态性SSR片段,每对引物的多态性片段有3-7个,引物平均检测效率为4.83个,Shannon’s遗传多样性指数范围是0.866-1.885,多态性位点比率100%。供试菌株遗传相似系数范围是0.618-0.971,说明毛木耳种质资源具有丰富的遗传多样性。野生菌株与栽培菌株间平均遗传相似系数分别为0.746、0.779,说明毛木耳野生菌株遗传多样性更为丰富。经聚类分析,在遗传相似系数为0.680时,可将供试菌株分为无色（白色）类群Ⅰ和有色（浅黄色到红褐色）类群Ⅱ。遗传相似系数为0.704时,可将供试菌株中栽培菌株和野生菌株明显区分（14株野生菌株均在类群Ⅱ-2中,13株栽培菌株分别在类群Ⅰ和Ⅱ-1中）。本研究表明基于全基因组的SSR标记能从分子水平上揭示各菌株间的遗传差异,丰富毛木耳遗传多样性的研究手段,并为进一步进行毛木耳的品种选育、遗传学研究等提供有力手段。
随着糙皮侧耳基因组测序的完成,基因组数据的深入挖掘和利用成为研究重点。本研究基于较高质量的糙皮侧耳CCMSSC00389-1和CCMSSC03989-1基因组图谱,开展了种内比较基因组学分析。CCMSSC00389-1和CCMSSC03989-1的11条染色体序列表现出良好的共线性,且分别含有89.92%和91.68%的保守基因。对菌株特有基因的GO富集分析表明,两菌株各自分化出一些独特的调控方式或途径。CCMSSC00389-1和CCMSSC03989-1之间共存在931 542个单核苷酸多态性位点,231 654个插入/缺失和9 221个结构变异。对与遗传变异重叠基因的GO富集分析表明,碳水化合物降解、物质运输/催化和调控/蛋白活性相关的基因分别容易发生SNP、In/Del和SV变异。CCMSSC00389-1中50.326kb缺失序列的断点两侧含有双链断裂修复（DSB）信号,推测DSB介导50.326kb序列的缺失。
担子菌类的食用菌种类多、价值高、产量大,然而其产业的升级发展需要对食用菌生长发育相关生物学问题进行深入解析。目前多种食用菌完成了全基因组测序,然而作为非模式种其与模式丝状真菌间的直系同源基因目前尚缺乏全基因组水平的系统研究,在一定程度上限制了其分子生物学研究的深入。本研究以草菇为参照物种,将其与几种食用菌和模式丝状真菌进行两两直系同源基因分析,并对多物种间不同类型的直系同源基因进行功能富集。结果显示：一对一直系同源基因较多富集于基因复制、转录、翻译、修饰、加工等保守的基本功能类别;非一对一直系同源基因多属于基因家族,且包含了65%的转录因子,功能上富集在碳水化合物、脂质、氨基酸、次生代谢物及外源物质的代谢通路。无直系同源基因则较多富集在与基因重组、修复、信号转导相关的功能类别、特导性转录因子以及未知的预测基因。结果为食用菌分子生物学的深入研究提供有价值的参考。
为探讨巴氏蘑菇子实体不同发育阶段基因的表达情况,本研究对巴氏蘑菇子实体不同发育时期（原基、采收期和开伞期）进行转录组测序,以本实验室已获得的巴氏蘑菇JA菌株的不育单孢菌株JA-15036基因组为参考基因组研究原基与采收期及开伞期样本间差异表达基因,并对差异表达基因进行了GO功能和Pathway富集分析。GO功能分析结果显示,差异表达基因主要富集在跨膜转运、碳水化合物代谢途径和膜组分,它们协同调控为子实体生长发育提供稳定的内环境。KEGG富集分析结果表明,原基期上调的差异表达基因主要富集在核糖体蛋白和DNA复制,表明原基期细胞代谢旺盛,其中核糖体蛋白基因上调为后期蛋白质合成提供重要场所;采收期和开伞期子实体时期差异表达基因主要富集在碳水化合物代谢、脂肪酸降解和氨基酸代谢等途径,为巴氏蘑菇子实体的生长发育与成熟提供营养与能量。
MYB蛋白是一类广泛存在于真核生物中的转录因子,在真菌的生长发育中发挥调控作用。本研究对冬虫夏草菌中的潜在MYB转录因子家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析,并研究了MYB家族成员在冬虫夏草生长发育不同阶段和不同部位的表达模式。结果表明,冬虫夏草MYB转录因子家族包含3个1R-MYB和3个2R-MYB;6个MYB转录因子蛋白均包含近50个保守氨基酸序列,形成螺旋-转角-螺旋的结构。通过分析MYB转录因子基因在不同发育阶段（MYB-1-6）和子实体不同部位（MYB-1、3、6）的相对表达量,发现MYB-1在冬虫夏草整个发育阶段表达较为稳定,MYB-3在子实体成熟阶段（MF）表达量最高,远高于其他阶段,且在MF的顶部可育部分MF-3高表达,表明其可能参与冬虫夏草子实体的有性发育;MYB-6在子座发育初期（YF）的中部YF-2表达量最高,为菌丝阶段（HY）的5倍,表明MYB-6可能参与子座柄部的伸长。
遗传转化方法是基因功能研究的重要方法之一,但在转化过程常出现转化子变异的现象,影响目标基因功能的判断。本文以阴环炭团菌菌落形态特征异常的拟基因TJAS01-V10012900敲除菌株12900-5为研究对象,通过PCR手段验证基因敲除的真实性,基因组重测序分析各转化子在基因敲除区域以及基因组其他区域的差异,转录组测序比较12900-5与其他转化子在基因表达层面的差异。比较基因组发现,12900-5与12900-6菌株在潮霉素抗性基因插入位置与片段一致,且不存在多拷贝现象。12900-5菌株有两个特异SNP位于不同的基因,一个与细胞周期S期有关,另一个与囊泡转运有关,两者均与菌丝生长有关。由此推测,转化子12900-5形态特征异常很有可能与这两个非靶标位点突变有关。转录组分析结果发现12900-5菌株在氨基酸代谢通路、翻译过程等多个代谢与信号途径基因的表达量明显下降。本研究例证了转化过程存在的非靶标变异现象,但导致这种变异的原因仍需进一步研究。
基于梯棱羊肚菌Morchella importuna两个子囊孢子培养物的全基因组测序数据,对全基因组范围内的变异位点进行分析。共鉴定到18 438个变异位点,平均每Mbp的变异位点数量为361个;变异位点以单核苷酸多态性SNP为主,共计17 104个,基因组中SNP的频率为335SNPs/Mbp;Indel多态性位点1 334个,以2-10bp的插入缺失为主;73.4% SNP/Indel位于基因间隔区域,外显子区域共检测到3 042个变异位点,占总数的16.50%;对基因功能产生确定影响的移码突变有1 088个,占5.90%,错义突变916个,占比4.97%;不同Scaffold上的SNP/Indel出现频率不同,SNP频率最大的为Scaffold80,平均每Mbp包含2 856个SNP,频率最低为Scaffold60和Scaffold75,分别为16SNPs/Mbp和30SNPs/Mbp;对≥11bp的Indel变异位点进行标记开发和多态性群体分析,成功开发出75对Indel标记。采用原生质体单细胞分离技术,获得了梯棱羊肚菌M04的两个可亲和的同核体菌株M04P01和M04P40,同时采用来自M04子囊果的58个单孢菌株作为作图群体,初步构建了包含75个Indel标记和1个交配型基因的梯棱羊肚菌遗传连锁图谱,共获得12个连锁群,连锁群总长度273.7cM。
肺形侧耳味道鲜美,营养丰富,深受广大消费者喜爱。它属于四极性异宗结合担子菌,但其交配型位点结构仍未被解析。本研究利用二代测序技术对肺形侧耳的基因组进行测序,通过生物信息学方法找到了肺形侧耳野生菌株X1菌株后代单核菌株的交配型位点。结果显示肺形侧耳的A交配型位点较为特异,2株原生质体单核化菌株（X1-1和X1-15）的A交配型位点结构差异较大,X1-1含一对保守的HD1和HD2基因,而X1-15除了一对HD1和HD2基因外,还含有额外的2个HD2基因和1个HD1基因。肺形侧耳的B交配型位点与其他担子菌的交配型位点相似,含有8个信息素受体基因和1个信息素前体基因。本研究揭示的肺形侧耳特异的交配型位点结构为后期的遗传育种提供了理论依据。
rDNA序列中的ITS作为DNA barcode广泛应用于真菌的系统发育与物种辅助鉴定,IGS被认为可以用于种内水平不同菌株的鉴别。有关食用菌rDNA序列的报道较少。本研究对毛木耳Auricularia cornea单核菌株B02进行三代测序与组装,然后用二代测序数据进行校正,得到一个组装效果较好的基因组序列。比对Fibroporia vaillantiir的rDNA序列获得毛木耳rDNA重复单元的完整序列,每个重复单元包含ETS、18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2、28S rDNA、IGS1、5S rDNA和IGS2,长度分别为398bp、1 790bp、156bp、156bp、206bp、3 432bp、2 247bp、121bp和2 135bp,总长度10 641bp,毛木耳rDNA有310个串联重复单元,转录组和系统发育分析均支持这一结果。与其他已报道的食用菌不同,毛木耳的IGS1、IGS2序列高度保守,其中IGS1的1 400-2 200bp区域在各拷贝之间没有多态性、而在品种之间有较高频率的SNP,这一片段序列有望用于品种鉴别研究。
本文以肺形侧耳栽培菌株X57为研究对象,对其低温胁迫时期进行转录组分析,发现差异基因显著地富集到麦角甾醇合成通路。根据麦角甾醇合成通路的相关信息,在肺形侧耳中筛选出该通路的17个基因,并推测了肺形侧耳的麦角甾醇合成通路。利用荧光定量研究了X57栽培袋在低温处理下该通路上各个基因的表达,结果显示随着低温胁迫时间的增加,该通路上大部分基因的表达量持续上升,且差异显著。检测栽培袋中菌丝麦角甾醇含量发现,低温胁迫显著提高麦角甾醇的含量,与RNA‐Seq分析结果一致。此外,以无需打冷也能整齐出菇的野生菌株X1为对照,比较X57与X1的麦角甾醇基因对冷胁迫的响应情况,探究麦角甾醇合成通路是否在肺形侧耳低温诱导形成原基时期具有关键性作用。将X57与X1菌株置于PDA平板上培养并进行低温胁迫,利用荧光定量PCR对各个基因表达进行验证,结果显示两个菌株的麦角甾醇合成通路相关基因均对低温胁迫有响应,X57低温胁迫时通路中绝大多数基因的表达量上升,且大部分基因表达量提高2倍以上;X1菌株的通路中的表达量变化较小。由此推测麦角甾醇通路在肺形侧耳变温结实中低温刺激形成原基有一定作用,为深入研究肺形侧耳低温胁迫调控分子机理提供了重要的基础。
金针菇Flammulina filiformis菌柄是产量构成的重要组成部分,也是评价质量的重要指标。菌盖下方0.6-1.5cm是菌柄的伸长区,其他区段不伸长。为了研究菌柄伸长的调控机制,我们采用液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）技术对金针菇菌柄的伸长区、过渡区和非伸长区进行检测,结合层次聚类分析（HCA）、t检验等统计学方法对差异代谢物进行研究,并通过KEGG分析代谢物富集情况。结果显示,共有69种代谢物在伸长区、过渡区和非伸长区呈现梯度差异,其中52种代谢物含量为梯度性降低,17种代谢物为梯度性增加。这些差异代谢物主要归属于脂肪酸、氨基酸、核苷酸、生物碱等,其中脂肪酸及其衍生物占主导地位,尤其是油酸、花生四烯酸和肾上腺酸含量在菌柄伸长区显著高于其他区段。根据金针菇菌柄的代谢物积累特点,推测脂肪酸及其衍生物可能参与调控金针菇菌柄伸长。
本研究以已经完成基因组测序的单核菌株“6-3”与“6-21”为出发菌株,配对后获得有锁状联合的异核菌株并进行出菇,收集担孢子,单孢分离获得90个菌株构成作图群体,对作图群体的每个菌株进行二代测序并测定菌丝在PDA培养基的生长速度。分析“6-3”与“6-21”两单核菌株的SNP,获得68 914个高质量SNP标记用于遗传连锁群分析,构建了14个遗传连锁群,总长度744.32cM,平均长度为53.17cM,标记间平均遗传距离为1.88cM。QTL分析获得一个控制菌丝生长速度的基因座qMGRP1-LG7,该基因座包含134个基因,富集了与物质代谢有关的通路和基因。
金针菇栽培通过提高栽培室CO2浓度来抑制菌盖生长,提高商品质量。碳酸酐酶能调节CO2/HCO3 -在细胞内的平衡,它可能是响应CO2胁迫的关键酶。本研究利用我们已完成的金针菇Flammulina filiformis的基因组测序数据,以双色蜡蘑碳酸酐酶家族基因为参照,通过本地BLAST,得到7个金针菇碳酸酐酶家族的基因,分别命名为CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7。基因结构、保守结构域和系统进化分析结果均支持这7个序列是碳酸酐酶家族的编码基因。高浓度CO2胁迫处理金针菇子实体12h,CA-1、CA-2表达量与CO2浓度正相关,CA-5负相关,CA-3、CA-4和CA-6没有响应,CA-7无明显规律。据此推测,CA-1、CA-2和CA-5可能是金针菇响应CO2胁迫的关键基因之一,参与调控菌盖生长发育。
