兰科植物与丝核菌类真菌,包括胶膜菌科、角担菌科和蜡壳菌科等形成菌根共生体。胶膜菌科真菌作为最广泛分布的共生菌根真菌,表现出与兰科植物的协同进化与密切关系。除了形态学特征分析和比较外,分子技术促进了兰科植物胶膜菌的分类学和多样性研究。兰科植物与胶膜菌的特异性可能限制兰科植物的分布和移栽后的生存能力,但有些兰科植物与胶膜菌的共生关系会因为地理分布或环境变化进行调整,使植物更好地生存,这种适应性为实现无菌苗菌根化来促进兰科植物的迁地保护或繁殖提供可能。本文综述了兰科植物共生菌根真菌胶膜菌在分类学、多样性、特异性和适应性等方面的研究。
蜜环菌属Armillaria真菌是世界范围内广泛分布的担子菌,既是引起森林病害的重要病原菌,也是天麻和猪苓生长的必须共生真菌,具有重要的经济价值。本文对我国鄂西天麻主产区即神农架林区、大老岭自然保护区、宜昌市所属的夷陵区和五峰县、恩施自治州等地进行了系统的调查采样,共获得45份蜜环菌子实体样本及其二倍体菌株,其中通过孢子印分离获得约320个单孢菌株。在此基础上,采用IGS、ITS和elongation factor-1 alpha（EF1-α）分子标记对45份二倍体菌株进行测序和系统发育分析,对有单孢株的样本采用遗传互交不育性实验进行生物种鉴定。结果表明,鄂西地区的蜜环菌分为4个clade,共有6个不同的蜜环菌生物种,分别为CBS J,CBS L,CBS N,CBS O,CBS F和Armillaria mellea,具有丰富的遗传多样性。其中,24个样本鉴定为CBS L,是鄂西地区的优势种;9个样本鉴定为CBS J;9个样本鉴定为CBS N;另有3个样本分别鉴定为CBS O,CBS F和Armillaria mellea。其中CBS L、CBS N、CBS O首次在湖北地区报道,扩大了这3个生物种的分布范围。本研究为了解鄂西地区蜜环菌的资源情况提供基础数据,对天麻生产蜜环菌菌种选育具有重要的参考价值。
基于宏条码技术对采自贵州遵义县、湖南慈利县和四川旺苍县3个杜仲产地根际土壤的真菌群落组成进行了分析。研究获得根际土壤真菌有效序列共10 775条,聚类后OTUs对应的真菌类群涉及子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、接合菌门Zygomycota、球囊菌门Glomeromycota、壶菌门Chytridiomycota、类原生动物门Rozellomycota的22纲、59目、103科、108个属的550个真菌分类单元（OTUs）。在属的水平上,湖南慈利样本（ECS）有119个属,优势属为镰刀菌属Fusarium,相对丰度为16.31%,其次是被孢霉属Mortierella（14.67%）、毛壳菌科Chaetomiaceae一未定属（13.01%）和木霉属Trichoderma（11.37%）等。四川旺苍样本（EWS）共有116个属,优势属为丝齿菌属Hyphodontia,相对丰度32.32%,其次为镰刀菌Fusarium（13.41%）等。贵州遵义样本（EZS）有110个属,优势属为被孢霉属Mortierella,相对丰度30.74%,其次是木霉属Trichoderma（25.96%）和镰刀菌属Fusarium（4.85%）等。α多样性分析表明,不同产地杜仲根际土壤真菌群落组成有明显差异。遵义样本（EZS）、慈利样本（ECS）和旺苍样本（EWS）的Shannon多样性指数从高到低为：ECS（2.7661）> EZS（2.4841）>EWS（2.1326）。不同杜仲产区土壤理化因子及4个主要活性成分（松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、京尼平苷酸和京尼平苷）与根际土真菌群落组成的相关性分析表明,4个主要活性成分皆为四川旺苍（EWS）产地含量最高,其次是湖南慈利,贵州遵义最低甚至不含京尼平苷。杜仲根际土壤样品真菌物种组成丰富,不同地区杜仲根际土壤真菌群落组成、分类单元的相对丰度及优势分类单元皆存在不同程度差异。杜仲根际土真菌群落结构的多样性与土壤理化因子及杜仲主要有效成分含量具有一定相关性。杜仲根际土真菌群落组成的结构谱是杜仲道地性的重要特征。
从2010年起,在江苏省丰县毛木耳Auricularia cornea 产区观察到蛛网病症状,该病害的发生呈逐年上升趋势,对毛木耳产量和产业造成了严重的损失。经过2015-2016年两年的调查研究,分析毛木耳蛛网病的发病规律。致病菌分别与毛木耳菌丝体和子实体的互作研究表明,该病原真菌仅危害毛木耳子实体,使毛木耳子实体的子实层出现裂缝,进而引起子实体畸形甚至停止生长。该病原本被鉴定为Cladobotryum cubitense。经37℃高温处理7d可抑制其菌丝的生长,50%咪鲜胺锰盐也能够抑制C. cubitense菌丝的生长,为减轻或控制毛木耳蛛网病的发生和传播提供了可行性策略。
通过氨基酸同源比对（Blast P）以及金针菇冷诱导前后菌丝阶段和原基阶段的转录组数据分析,获得了金针菇中的两个假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、Fvgpcr2。对获得的金针菇假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、Fvgpcr2构建了基因组编辑（CRISPR/Cas9）的pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr1- sgRNA1/sgRNA2、pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr2-sgRNA1/sgRNA2等4个表达载体。通过农杆菌介导（ATMT）将表达载体pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr-sgRNA转化金针菇菌丝体,采用潮霉素和头孢毒素低浓度初筛和高浓度复筛,经两段筛选获得金针菇拟转化子。经对拟转化子进行PCR鉴定、RT-qPCR检测和Western杂交验证,结果显示表达载体pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr-sgRNA成功整合进金针菇基因组中,FvCas9蛋白正常表达,但未得到Fvgpcr基因敲除突变体。本研究利用农杆菌介导转化法在金针菇中构建了CRISPR/Cas9敲除体系,对后续目标基因的敲除有着重要意义。
多糖单加氧酶（polysaccharide monooxygenase,PMO）是一种铜离子依赖的氧化酶,属于辅助活性酶类第九家族（auxiliary activity 9,AA9）,在存在电子供体维生素C（vitamin C,Vc）的情况下,可以氧化裂解纤维素的多糖链,显著提高纤维素的酶解效率。本文克隆了嗜热革节孢Scytalidium thermophilum AA9家族的一个编码基因pmo7651,并在毕赤酵母GS115进行诱导表达,通过His标签获得了重组蛋白PMO7651-His。以磷酸膨胀纤维素（PASC）为底物进行酶促反应,薄层层析法（TLC）结果显示PMO7651酶解产物主要为纤维二糖至纤维五糖;飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）和溴氧化法确定PMO7651具有C1、C4、C6位的氧化活性;底物结合平面的3个芳香族氨基酸位点突变对酶的活性具有不同程度的影响;在PMO7651帮助下,纤维素酶的降解效率均具有不同程度的提高。
光在调控真菌的多种生理过程中发挥着重要作用。为探究光照对新蚜虫疠霉Pandora neoaphidis产孢的影响,本文研究了不同波长光源（蓝光、绿光、白光、红光、黄光）和无光黑暗条件对新蚜虫疠霉分生孢子弹射能力的影响,通过cDNA末端的快速扩增（RACE）对新蚜虫疠霉的蓝光受体蛋白基因pnwc-1进行克隆并对其进行生物信息学分析,利用qRT-PCR对蓝光光源不同照射时长下pnwc-1的表达量进行了定量分析。结果表明,蓝色光源（波长460-465nm）照射后的新蚜虫疠霉菌丝产生的分生孢子数量显著高于其他波长光源,排序为：蓝光>绿光>白光>红光>黄光>无光。另外,分析克隆获得的全长为2 423bp的pnwc-1基因发现,其编码的蛋白具有蓝光受体蛋白典型的保守结构域,同源比对结果显示新蚜虫疠霉与接合菌门真菌归为一类但相对独立。qRT-PCR的定量分析结果表明随着照射时长增加,蓝光处理能显著提高pnwc-1的表达量,而且pnwc-1的相对表达量与累积产孢量存在正相关（R 2=0.9798）。本研究为后续蓝光及其受体基因功能的深入研究提供了实验基础,并促进以新蚜虫疠霉为代表的虫霉目真菌在害虫生物防治中的应用。
白腐菌是目前已知的唯一能将木质素彻底降解的微生物,而漆酶在木质素分解过程中起着重要的作用,被广泛应用于农作物秸秆或甘蔗渣等多种类型生物质的生物预处理和生物降解。本研究利用白腐菌产漆酶发酵培养基对30株血红密孔菌Pycnoporus sanguineus菌株进行筛选,得到了多株漆酶高产菌株,并研究了血红密孔菌发酵粗酶液和菌丝对烟梗的生物降解条件。研究结果表明：血红密孔菌及其产生的漆酶表现出了对烟梗木质素较强的生物降解能力。在漆酶浓度为40U/mL、温度30℃、pH 4.5的条件下处理24h,烟梗中木质素的降解率可达到50.4%,纤维素和半纤维素的降解率分别为17.5%和17.3%;漆酶浓度为5U/mL、温度30℃、pH 4.5的条件下处理48h,木质素降解率可达到65.1%。血红密孔菌菌丝也表现出对烟梗较好的生物降解效果,接种培养7d后烟梗中木质素降解率可达30%以上,21d后木质素的降解率可达79.1%,而纤维素和半纤维素的降解率仅为20%和12%左右。本研究不但为生物质材料的生物预处理和生物降解提供了优质的白腐菌及漆酶资源,还为通过烟梗的生物预处理提高烟草梗丝和卷烟品质提供了重要参数,具有一定的应用前景。
纤维素酶是生物燃料产业的关键酶系。本文通过刚果红染色法从腌制一年的诺邓火腿上分离到一株具有纤维素酶活性的嗜盐真菌YFCC2018SY。以形态学结合分子系统学手段对其进行鉴定,用胞外酶活测定法探索其产酶规律,并通过响应面法优化其产酶条件。结果表明该菌株属于球孢枝孢菌,且能分泌滤纸酶、内切酶和β‐葡萄糖苷酶3种嗜盐纤维素酶。响应面分析得到最优发酵条件为：NaCl含量88.58g/L、装瓶量51.21mL、起始pH 7.72。通过优化,纤维素酶活力由113.3U/mL提高到302.8U/mL,提高了167%。上述结果可以为嗜盐纤维素酶开发利用提供参考。
粗毛纤孔菌胞外多糖是粗毛纤孔菌液体发酵的重要活性代谢产物,但采用常规的发酵方法,粗毛纤孔菌胞外多糖的产量较低。为更好地获取粗毛纤孔菌胞外多糖,本文采用双向液体发酵的方法,通过向发酵培养基中添加适量的扁桃斑鸠菊叶粉末,来提高粗毛纤孔菌胞外多糖的产量,并对优化得到的胞外多糖抗氧化活性进行了研究。以发酵液中胞外多糖含量为指标,采用单因素实验和正交实验优化发酵条件;采用红外光谱对胞外多糖的结构特征进行分析;通过测定胞外多糖对ABTS、DPPH和羟基自由基的清除率来了解其抗氧化活性。结果表明,最优发酵条件为：扁桃斑鸠菊叶粉末添加量0.5g/L、发酵时间10d、pH 6.5、接种量5.0mL,在此条件下,粗毛纤孔菌胞外多糖的产量达到(2.34±0.25)mg/mL,与未添加扁桃斑鸠菊叶的空白组相比,其胞外多糖产量提高了约216.22%;红外分析与抗氧化活性实验结果表明,添加扁桃斑鸠菊叶后的胞外多糖与未添加扁桃斑鸠菊叶的胞外多糖红外主要吸收峰一致,并且对ABTS、DPPH以及羟基自由基清除能力相近。本研究结果表明扁桃斑鸠菊叶能够有效地提高粗毛纤孔菌胞外多糖的产量,为其他珍稀食药用菌胞外多糖的高效生产提供了新思路。
黑色素是黑木耳的主要活性成分之一,在黑木耳的药理活性上发挥着重要作用。为了提高黑木耳黑色素的提取得率,实验采用正交法和响应面法对纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的提取工艺进行了优化,并对最优条件下提取的黑木耳黑色素体外抗氧化活性进行了分析。实验结果表明,纤维素酶-超声波协同提取黑木耳黑色素的最优条件为：酶添加量12mg,酶解温度40℃,酶解pH 5.0,酶解时间120min,NaOH浓度1.27mol/L,料液比1:40,超声功率300W,超声时间52min,超声温度60℃。在最优条件下,黑木耳黑色素提取得率可达到10.48%,相比于实验设置的未添加纤维素酶的超声波组黑色素提取得率提高了12.93%。抗氧化结果表明,采用纤维素酶-超声波协同提取的黑色素相比于未加纤维素酶提取的黑色素清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力更强。研究结果为黑木耳黑色素的高效提取及其产品的应用开发奠定了基础。
本文对白囊耙齿菌子实体不同提取物防治慢性肾小球肾炎进行研究,采用腺嘌呤灌胃法建立小鼠慢性肾小球肾炎模型,探究白囊耙齿菌子实体水提取物和醇提取物的高、中、低剂量组对慢性肾小球肾炎的预防作用及不同提取物的高剂量组对慢性肾小球肾炎的治疗作用,并对小鼠体重进行测量,检测尿蛋白（UP）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总胆固醇（TC）、超氧歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）指标,分析肾、肝、脾、胸腺的病理变化。结果表明,水提取物中剂量（240mg/kg）能显著降低小鼠尿蛋白含量和肾组织中炎症因子含量,使血清生化指标维持正常,并对免疫器官有保护作用;醇提取物高剂量（200mg/kg）对慢性肾小球肾炎有治疗作用,但对免疫器官保护作用较弱。研究表明,白囊耙齿菌子实体水提取物中剂量具有预防慢性肾小球肾炎的作用且效果优于阳性药肾炎康胶囊,具有开发利用潜力,机制有待于进一步研究。
玉米赤霉烯酮（zeralenone,ZEN）具有雌激素活性,主要污染谷物和饲料,大量聚积可导致流产和死胎,给动物和人类健康带来严重威胁。本研究通过将ZEN偶联抗原ZEN-BSA包被于纳米磁珠（magnetic nanoparticles,MNPs）,制备纳米磁珠-偶联抗原复合物（MNPs-BSA-ZEN）,同时使用金颗粒（Au nanoparticles,AuNPs）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）双标记的ZEN单克隆抗体,建立新型酶联免疫检测方法（MNPs-HRP-AuNPs IC-ELISA）。检测下限（IC10）达到0.03ng/mL,检测区间（IC20-IC80）为0.05-0.89ng/mL,半数抑制率（IC50）为0.22ng/mL,与ZEN类似物（α-zearalanol、zearalanone、α-zearalenol、β-zearalenol和β-zearalanol）的交叉反应性依次为19.2%、11.7%、8.3%、1.2%和4.3%,与黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、桔青霉素和展青霉毒素几乎不存在交叉反应。在玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达81.6%-113.5%,与LC-MS/MS同时对天然样本中ZEN含量的检测结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的MNPs-HRP-AuNPs IC-ELISA具备快速和高灵敏的双重优势,也可为其他霉菌毒素精准检测技术的开发提供参考。
