本研究收集了国内外28株大球盖菇菌株,通过SRAP分子标记技术和耐高温递进式循环驯化选择出2株适合的实验材料,采用原生质体融合、原生质体再生技术进行耐高温菌株初选,筛选出2株性状优良的耐高温菌株（S20菌丝耐高温、产量高;R10 I级菇比例高、子实体耐高温）,收集2菌株出菇后的孢子进行单孢杂交,在高温条件下通过多次继代培养和栽培实验,最终确定出J8L4（山农球盖3号）为最优耐高温高产菌株。该菌株能连续7d在最高料温达27-34℃、最高气温达40-47℃条件下生长良好,无杂菌污染,40d出菇,其产量达到14.56kg/m 2,生物转化率为91.03%,优质菇比例为66.21%。研究结果表明,通过多层次的驯化筛选和多项育种技术的综合使用,使得所选菌株的优良性状更显著,遗传稳定性更好。
插入位点分析对于金针菇功能基因组学的研究极为重要,分析方法常用反向PCR、热不对称交错PCR、Tail-PCR、染色体步移等,存在操作复杂、消耗时间长、特异性较差、效率低等缺点。近年来开始应用基因组重测序的方法,对转化子逐一测序与分析,工作量较大、费用较高。本研究应用矩阵设计,把多个转化子的DNA混合构成样品池,重测序后分析插入位点,M个样品池的测序数据可分析M×(M+1)/2个转化子的插入位点。应用矩阵设计构建6个样品池检测21个转化子,获得21个插入位点,表明这种方法可行、适合大样本分析,如突变体库。
细胞色素c过氧化物酶（cytochrome C peroxidase,CcP）是细胞内H2O2的主要降解酶,参与真菌的氧化应答过程。本研究基于基因组数据获得一个金针菇细胞色素c过氧化物酶编码基因,命名为ffccp。该基因全长1 913bp,包含一个1 098bp的完整开放阅读框,编码365个氨基酸。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质（FfCcP）无跨膜结构和信号肽,不形成二硫键结构,亚细胞定位于线粒体上,具备血红素结合蛋白的保守位点。序列比对和进化分析结果显示,金针菇与糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等大型真菌的CcP序列高度相似（相似度均超过70%）,属于CcP家族蛋白。RT-qPCR的检测结果显示,氧化胁迫和损伤胁迫均能诱导ffccp基因上调表达,但两种胁迫对ffccp表达的调控机制可能并不相同。进一步检测ffccp在子实体发育过程中的差异表达情况,发现ffccp在伸长期菌柄出现显著上调表达,且表达量与菌柄伸长速度的相关性达到0.998,为极强正相关。推测ffccp的上调表达可能有利于菌柄的伸长。
磁场作为一种无法避免的自然因子,对生物的生长发育有重要影响。然而,目前磁场对大型真菌影响的研究还鲜有报道。本研究采用铷磁铁对金针菇菌丝进行处理,检测金针菇菌丝在不同磁极刺激下的生长和基因表达规律。结果显示：磁场是铷磁铁抑制金针菇菌丝生长的主要原因,且在磁感应强度0.003T以上对菌丝生长的抑制作用较强。通过同源比对获得一个金针菇磁受体和一个铁离子转运蛋白的编码基因,分别命名为ff-magr和ff-fief。定量PCR结果显示ff-magr在N极和S极均出现显著下调表达,N极和S极磁场对ff-fief 的表达均无显著影响。结果表明：磁受体蛋白参与了金针菇菌丝受磁场抑制的应答过程,而磁受体不仅仅是通过调控铁的含量来调控菌丝的生长发育。以上结果为合理利用磁场调控真菌生长发育奠定基础,同时也为深入研究磁场对真菌生长发育的分子机理提供参考。
通过对来自国内外的28份金针菇菌株资源的重测序共计检测到SNP位点1 241 583个,InDel位点623 670个。通过筛选分型,1 474个高质量SNP标记（多态信息含量指数PIC介于0.101-0.966之间）被用于金针菇资源群体多样性和结构分析。经计算,菌株间遗传距离在0.057-0.631之间。UPGMA进化树拓扑结构显示栽培菌株是其与野生菌株混合分支的一个亚支,自然栽培和工厂化栽培菌株可各自聚成一支,符合金针菇育种历史。群体结构结果显示金针菇种质资源包含5个亚群。主成分分析显示菌株在二主分之间的位置及互相间距离基本符合进化树分类、群体结构和遗传距离。本研究为金针菇分子标记和基因型的确定提供序列基础,也为后续资源保护利用、重要农艺性状的基因定位和基于分子标记的聚合育种提供理论依据。
以毛木耳Auricularia cornea杂交子APM2-16的亲本单核体APP7和M2S16为研究材料,经同源序列比对,从单核体APP7的基因组中获得了A交配型位点序列,并定位了mip基因的位置。根据APM2-16的转录组和单核体APP7基因组的相关信息设计引物,通过PCR扩增和克隆测序的方式获得单核体APP7和M2S16中的HD基因序列,通过生物信息学分析发现两者在核苷酸序列上没有同源性,都编码同源结构域转录因子。通过对毛木耳交配型位点的研究有助于进一步开展该物种的遗传学基础研究,为菌种遗传改良奠定基础。
为了探明漆酶在斑玉蕈生长发育过程中的功能,对斑玉蕈转录测序预测的13个漆酶基因序列进行分析、鉴定和构建分子系统发育树;检测了不同生长发育时期漆酶的活性和漆酶基因表达水平。研究结果显示：13个基因片段中有10个是漆酶基因。不同的漆酶同工酶之间进化关系存在明显差异,大多数漆酶与木腐菌（金针菇Flammulina filiformis和侧耳属Pleurotus）进化关系较近。对斑玉蕈不同生长发育时期的酶活检测结果显示,从斑玉蕈的菌丝恢复期到钉头期,漆酶活性逐渐升高,而在子实体形成后期酶活逐渐降低。对培养40d、60d和80d的菌丝样品以及不同生长发育时期的样品进RT-qPCR检测,结果显示在菌丝营养生长时期,大多数漆酶基因在第40-60天表达量持续增加1-3倍,而在第60-80天时表达量出现降低的情况。而在生殖生长时期,大多数漆酶基因在转色期或者原基期相对表达量达到最大值,并在子实体期出现降低,这与漆酶活性的检测具有一致性。lcc3、lcc7、lcc8和lcc9在斑玉蕈生殖生长过程中相对表达量出现了10-100倍的上调。这说明从菌丝培养到菌丝扭结形成子实体和子实体发育的过程中,不同的漆酶可能发挥着不同的作用,表达量较高的漆酶基因可能对基质降解和子实体形成起主要作用。
新鲜草菇味道鲜美,香味浓郁,而且营养丰富,是具有中国特色的食药用菌。草菇采后极易开伞,低温贮藏（10℃以下）则容易自溶、渗水腐、发出异味,是最不易贮藏的食用菌之一。本课题组先前的研究表明草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因可能在草菇菌柄的伸长、菌盖的开伞过程中起到一定的作用。因此,本研究以Vvrin1基因为研究对象,构建该基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法进行转化草菇异核菌株H1521菌丝块。通过潮霉素抗性平板筛选,PCR扩增潮霉素抗性基因及Vvrin1基因过表达特异片段,qRT-PCR分析拟转化子菌株内的Vvrin1基因表达量,最终获得了8个比较可靠的转化子。进一步对这些转化子的表型进行初探,发现其中7个转化子的生长速度比出发菌株H1521快,具有显著性差异（P<0.05）,且转化子菌丝更浓密,菌落表面颜色更深,推测草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因可能参与了菌丝阶段生长速度和色素合成或积累的调控。研究结果为进一步研究草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因的功能提供了菌株材料及数据支持。
本研究对香菇锰过氧化物酶基因（manganese peroxidase 1,MnP1）进行了生物信息学分析,选用香菇出发菌株18和诱变菌株18N44作为实验材料,经测定高温胁迫后菌丝恢复生长速度,分析了高温胁迫过程中香菇锰过氧化物酶基因（LeMnP1）的表达水平及酶活性。结果表明：LeMnP1定位于细胞外,该蛋白属于过氧化物酶超家族,与其他担子菌具有较高的同源性。18N44在高温胁迫后其恢复能力明显强于18;在高温胁迫过程中,18N44中LeMnP1的基因表达水平均高于18,呈现先上升后下降的趋势;在未处理时,18N44的MnP活性显著高于18,随着高温胁迫时间延长,其酶活性显著下降,18的LeMnP1基因表达量及酶活性在整个高温胁迫过程中基本维持稳定。据此推测锰过氧化物酶基因的相对高表达,可能是18N44高温胁迫后恢复生长快的原因之一。
金针菇是低温结实型菌类,原基形成需要低温诱导,子实体发育也需要较低的温度,因此在工厂化生产过程中能源消耗大,生产成本高。本研究利用转录组测序对金针菇菌丝体和原基进行RNA-Seq分析,筛选得到7 935个差异表达基因,在原基形成后,有4 025个基因上调表达以及3 910个基因下调表达。通过GO注释和KEGG通路注释等生物信息学手段对代谢途径进行分析,可推测冷诱导形成原基的代谢调控为：当金针菇菌丝细胞接受到冷信号后,糖分转运相关的基因表达量下降,导致碳源摄取效率下降,因而糖酵解途径大部分相关基因表达量下调,进而导致三羧酸循环的底物乙酰辅酶A（乙酰CoA）合成量减少,整个细胞能量产出下降。此负反馈信号使细胞内储存的脂质进行氧化代谢的基因表达上调,产出乙酰CoA以供三羧酸循环产能。此负反馈导致不饱和脂肪酸的合成基因表达上调,以调节细胞流动性;同时磷脂和鞘脂代谢通路的相关基因表达大多上调,合成增多,细胞膜的组分因此改变,因此细胞进行重构进入另一种状态。与DNA复制、RNA转录和蛋白质合成的相关基因表达均大部分上调,表明了原基形成时细胞正处于增殖旺盛时期。本研究结果从分子水平上揭示了金针菇原基的形成伴随着能量来源的转变,各个代谢途径的相互调控以及相关基因的表达影响,为有目的培育高温型金针菇新品种,减少栽培能耗提供理论依据。
为科学评价食用菌与果蔬两类食材的营养特征与口感风味,本研究选取4种常见食用菌（金针菇、斑玉蕈、香菇、双孢蘑菇）和4种常见果蔬（苹果、香蕉、胡萝卜、番茄）,采用氨基酸自动分析仪测定其游离氨基酸,系统比较了两类食材的游离氨基酸组分比例及呈味特征。主成分和聚类分析表明 4种食用菌和4种果蔬显著分为两类,食用菌类游离氨基酸总量平均是果蔬类的3倍以上,4种食用菌中各游离氨基酸的比例均衡。4种食用菌的必需氨基酸/(必需氨基酸+非必需氨基酸)在40%左右,必需氨基酸/非必需氨基酸接近或大于60%,均接近理想值。4种食用菌所含的呈味氨基酸（鲜味、甜味、芳香族、苦味）均是4种果蔬的2倍以上,TAV值最显著的是：谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸和丙氨酸。这些氨基酸分属在五大氨基酸家族,在食用菌与果蔬中代谢途径相同;只有赖氨酸在二者中的合成途径不同。结果表明供试的食用菌比果蔬有优质的氨基酸比例和丰富的呈味组分,此差异体现在众多氨基酸的代谢层面,而非个别氨基酸导致。
本研究在分析金针菇减数分裂重组热点时发现B交配型位点可能存在第三个亚位点,为此对同核菌株‘6-3’和‘6-21’的B交配型位点进行全基因组注释,获得8对同源信息素受体基因（pheromone receptor gene,pr）和3对同源信息素前体基因（pheromone precursor gene,pp）,组成了2个结构完整、相距326kb的亚位点α和β;‘6-21’菌株还发现1个‘6-3’菌株不具有的pr,组成第3个亚位点γ,它与亚位点α和β没有连锁。‘6-3’和‘6-21’配对形成异核体后出菇,分离获得142个单孢菌株,其B交配型有8种基因型,通过亲和性试验得到证实,同时还验证了第3个亚位点γ具有与α、β相同的功能。
柱状田头菇（茶树菇）Agrocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有极高的经济价值。随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。本研究以柱状田头菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因,应用PEG介导法进行柱状田头菇遗传转化体系研究。结果表明,150μg/mL潮霉素可以完全抑制柱状田头菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3h,能够获得最大得率的原生质体。通过PEG介导将构建好的DNA片段转化入柱状田头菇原生质体,通过潮霉素抗性筛选获得转化子,转化得率达到7个/μg DNA。PCR验证和荧光显微镜观察,外源片段成功转入柱状田头菇中并稳定表达。本研究建立的PEG介导转化体系,为柱状田头菇基因功能研究提供了技术基础。
香菇是我国深受欢迎的食药用菌,产量居食用菌产业之首。为拓宽栽培香菇菌株的遗传背景,解决现有主栽香菇菌株种性退化的问题,本研究以香菇‘808’菌株与3个香菇野生资源、3个栽培菌株（辽抚4号、BY1和荷香）开展单-双杂交育种,开发适合当地栽培环境的主栽品种。研究结果显示：在270对单-双杂交组合中,通过锁状联合观察和与亲本的拮抗试验,鉴定出89个杂交子,进一步通过栽培试验筛选出10个性状相对优良的候选菌株;最终通过农艺性状对比试验,筛选出ZJXG 5和ZJXG 8两个优良杂交菌株,这两个菌株均以当地长白山野生资源S1和本地主栽菌株BY1为双核杂交亲本选育而来,表现出超亲显著、菇形圆整、颜色呈浅褐色的特性,前4潮生物学效率在86%-88%之间。本研究结果揭示,在香菇杂交育种中,当亲本菌株来源地域与杂交后代菌株筛选地域相近时,单双杂交亲和率、杂交菌株的出菇率和丰产性指标较高,这提示我们,利用当地野生香菇资源更有利于创制适合当地自然环境的地方品种。
本研究对来自不同单孢和不同萌发孔菌丝的166份羊肚菌菌株进行形态研究、交配型基因检测、基于ISSR的遗传多样性分析和菌株杂交选育。结果表明,来自不同单孢及其不同萌发孔菌丝培养的菌株间均存在不同程度的形态和遗传差异。4条ISSR引物共扩增出条带清晰的22条多态性谱带,多态性比率为88%。基于遗传相似性系数（GS）、不加权成对群算术平均法（UPGMA）构建的系统树,可将供试菌株分为梯棱羊肚菌Morchella importuna和六妹羊肚菌M. sextelata两大类群。聚类分析发现不同物种间的单孢菌株和单丝菌株的遗传差异显著;同一单孢不同萌发孔菌丝的菌株间存在较大的遗传分化,遗传多样性丰富。交配型基因检测证实羊肚菌是异宗结合型真菌,同一单孢的不同萌发孔菌丝体含相同的交配型基因（MAT 1-1-1或MAT 1-2-1）。遗传多样性结果表明：梯棱羊肚菌比六妹羊肚菌的遗传背景更广泛。此外,ISSR分子标记也表明仅依靠菌丝和菌核的形态特征并不能准确衡量羊肚菌菌株间的亲缘关系。研究羊肚菌单孢菌株、单丝菌株间的形态和遗传特征,将为羊肚菌优质菌种的精准选育提供理论参考。
刺芹侧耳是一种典型的具四极性交配型系统的担子菌,通常需要一对可亲和的单核菌丝体才能够形成稳定的双核菌丝体。本研究将刺芹侧耳单核菌株181（A1B1）中A和B交配型基因HD1和HD2以及信息素前体基因PEphb3.1和PEphb3.3克隆后,通过PEG介导的方式敲入到可亲和的单核菌株183（A2B2）中,获得了22个阳性转化子。运用荧光显微镜对其中11个具有锁状联合的转化子进行了详细观察,描述了锁状联合和细胞核相。研究结果为进一步开展交配型基因的遗传操作研究提供了方法学上的借鉴和参考。本文还探讨了同核双核体的概念和应用价值。
典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA1_1家族）,而AA1_2家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA1_2家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1_2家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA1_2家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA1_2多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64kDa,表现出亚铁氧化酶（EC 1.16.3.1）与漆酶（EC 1.10.3.2）双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH 4最高,漆酶活性在pH 6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn 2+、Hg 2+和Pb 2+抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。
大球盖菇Stropharia rugosoannulata是一种具有较强木质纤维素降解能力以及高营养的重要食用菌。此菌属于四极性异宗结合担子菌,但是交配型位点结构仍未被解析。本研究利用基因组数据通过生物信息学方法进行大球盖菇的A和B交配型位点解析,并与其他大型真菌进行比较。结果显示大球盖菇的A交配型位点包含了一对保守的HD1和HD2基因,位点上下游基因的共线性较高,与Galerina patagonica和砖红韧黑伞Hypholoma sublateritium相似度最高,A位点结构上也较为保守,在上下游具有保守的MIP、Sec61蛋白、甘氨酸脱氢酶和β侧翼蛋白。B位点包含5个信息素受体和3个信息素前体基因,与其他真菌相比较发现,B位点及上下游基因的共线性较差,表明在不同的真菌中B位点变异性较大。本研究所获得的结果将有助于诠释大球盖菇交配型位点结构,为今后的遗传育种提供了理论依据。
漆酶是香菇生长发育过程中一种重要的木质素降解酶,其活性高低对于香菇木质素降解能力和香菇品质形成具有重要作用。为探讨香菇不同漆酶活性的单核菌丝体基因表达变化,对漆酶活性存在差异的单核菌丝体进行转录组测序分析,共获得15 522个注释基因。GO（gene ontology）分析表明差异基因在氧化还原酶活性节点大量富集,包括参与木质素降解的酶类及55个细胞色素P450基因;KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析发现淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化途径中糖苷水解酶、UDPG脱氢酶等基因上调表达。通过搜索转录因子数据筛选到172个差异表达的转录因子,预测了可能与漆酶结合的bZIP、C2H2、C4转录因子家族。由此推测,在漆酶高产单核菌株中木质素降解和碳水化合物代谢的相关基因的表达发生变化,及糖醛酸和磷酸戊糖途径相关基因上调表达,促进了木质素降解产物高效转化成糖、核酸等生物大分子,有助于香菇菌丝体的生长,转录因子在漆酶活性调控中起了重要作用。本研究为深入理解香菇漆酶高产菌株的生理代谢机制提供了重要的基因数据资源。
随着我国印染工业的发展,废水对生态环境的危害日趋严重,亟需开发一种脱色明显且成本低廉的降解方法。本研究发现毛木耳Auricularia cornea菌株AC5对不同结构的染料均具有一定的降解作用,尤其是三苯甲烷类染料。利用26℃、160r/min振荡培养7d的粗酶液对染料（75.0mg/L）进行12h降解,结果显示三苯甲烷染料孔雀石绿、结晶紫,蒽醌染料活性蓝19和偶氮染料活性蓝222的降解效率分别为83.27%、71.77%、67.81%和63.92%。染料降解实验和酶活力测定结果表明,毛木耳对孔雀石绿的降解率达到最高时漆酶活性最高,为321.0U/mL,木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性较低。因此,推测在降解过程中漆酶起到主要作用。研究表明利用毛木耳菌丝发酵液降解染料废水成本低且操作方便,为染料废水的降解研究提供了前期基础。
银耳‘Tr2016’是由福建省尤溪县枕头山的枯木上发现的一株野生银耳,进行反复多次分离和多年驯化而来。银耳菌丝具锁状联合,可形成白色或淡黄白色菌落;子实体呈雪白色,由多片波浪状卷曲的耳片组成牡丹花状,烘干后为淡黄色。栽培周期从接种到采收约45d,鲜耳平均直径13.2cm,高度7.2cm,平均产量为114.0g/瓶,干耳平均产量34.1g/瓶。
斑玉蕈‘Finc-B-7’品种是以‘Finc-B-3’菌株为亲本采用单孢自交育种技术选育的。新菌株具有十分清晰的大理石斑纹,经拮抗测试,显著区别于亲本菌株,适宜培养温度为18-23℃,最佳培养周期为70d,相应栽培周期为21d,平均单产为188g/瓶,是一个品质优良的斑玉蕈高产新品种。
通过从香菇‘武香1号’自然变异菌株的分离培养,多次人工定向选择,以及连续4年的系统选育,评价筛选,育成中高温型香菇‘丽香2号’。该品种具有菇柄短、菇盖厚、盖色浅、菇肉紧实以及出菇早、出菇潮次明显、不易开伞等优点。区试平均每袋（袋规格15cm×55cm）产526g,高于出发菌株15.2%,菇品质优于‘武香1号’和‘L9319’,是适宜于浙江一带夏秋出菇栽培的品种。
‘浙黄1号’是野生桑黄通过驯化系统选育的新品种。其子实体呈扇形或马蹄形,菌盖长径6.0-15.0cm,短径3.0-5.0cm,基部厚2.0-5.0cm,边缘厚0.2-2.0cm。子实体表面呈金黄色至棕黄色,菌肉黄褐色。菌丝体生长适温25-30℃,子实体发育适温20-25℃。子实体总黄酮含量8.26%,粗多糖含量5.40%,总三萜含量0.96%。浙江省地区有春、秋两季栽培;抗逆能力较强,子实体成品率较高、整齐,商品化程度高,产量13.3g/袋（干料470g）。适宜代料栽培。
‘双孢106’是‘A20’通过单孢选育的品种。子实体散生,少量丛生,近半球形。菌盖白色,表面光洁,直径3.5-5.0cm,厚2.0-3.0cm,质地致密;菌柄白色,粗短,近圆柱形,基部略膨大,长2.0-2.8cm。发菌适温22-25℃,子实体生长发育温度10-24℃,最适温度16-18℃。鲜菇粗纤维含量1.00%,蛋白质含量3.54%,氨基酸总量2.84%。该品种出菇早,子实体圆整、结实,产量高,商品化等级高。适宜双孢蘑菇工厂化设施栽培。
