作为虫草属的模式种,蛹虫草是目前虫草类真菌中研究和应用最为广泛的物种之一。随着基因组序列的公布,蛹虫草组学水平的研究近年来取得了明显的进展。本文从基因组、线粒体基因组、甲基化组、转录组、蛋白质组、代谢网络等角度对蛹虫草组学水平的研究现状进行综述,期望对进一步推动蛹虫草的深入研究提供帮助。
虫草为一类具有悠久利用历史的真菌。随着研究的逐渐深入,虫草的概念也随之改变,同时也带来了机遇和挑战。虫草已由独处深闺变得与人们生活密切相关。本文从概念出发,对虫草的研究历史、物种界定、分类研究,以及开发应用前景进行了综述和展望。
光调控真菌的生长发育和代谢产物合成,是大多数食用菌子实体分化必不可少的环境因子。蛹虫草是一种具有重要药用价值的食用真菌,光因素对蛹虫草的分生孢子数量、生长速率、子实体发育、昼夜节律以及次级代谢产物虫草素和类胡萝卜素的合成均有较大的影响。目前,基于蛹虫草全基因组的解析和遗传操作系统的建立,已鉴定出7种光受体,white collar-1（WC-1）、WC-2、Drosophila-Arabidopsis- Synechocystis-human type cryptochromes（CRY-DASH）、CRY-2、环丁烷嘧啶二聚体光裂合酶（cyclobutane pyrimidine dimer,CPD）、VIVID（VVD）和光敏色素（phytochrome,PHY）。本文较系统地总结了上述光受体的蛋白结构特征,全面阐述了光受体介导光信号调控蛹虫草菌丝生长、子实体发育及次级代谢产物合成等方面的分子机制,并对后续研究进行了展望,为深入研究蛹虫草光受体的具体功能和相关机制提供参考。
蚁生线虫草是一种重要的蚁科专化性虫生真菌。为明确双版纳自然保护区不同生境蚁生线虫草的分布规律,以期为蚁生线虫草的开发利用提供依据,于2017年7月-2018年9月对西双版纳自然保护区石灰岩山季雨林（高、中、低海拔带）、热带季雨林、季风常绿阔叶林、热带丛生竹林、暖热性针叶林5种不同生境中蚁生线虫草的分布及其寄主进行了系统调查。结果表明,在5种不同生境中,共采集蚁生线虫草1 449株,其主要分布于石灰岩山季雨林和热带丛生竹林,相对多度分别为51.1%和24.3%;其次为暖热性针叶林生境,相对多度为15.2%;热带季雨林和季风常绿阔叶林中分布相对较少,相对多度分别为5.7%和3.7%。从同一生境的石灰岩山季雨林不同海拔带的分布来看,蚁生线虫草主要分布于高海拔地带（33.7%）,而中海拔地带（9.7%）和低海拔（7.8%）相对较少。从季节性流行规律来看,西双版纳自然保护区蚁生线虫草的流行期为湿热季的6-10月及湿热季与雾凉季交替的11月。蚁生线虫草寄主多样性丰富,包括4亚科13属16种。该研究将为西双版纳自然保护区生物多样性及蚁生线虫草保护利用提供理论依据。
蛹虫草子实体形成及发育的蛋白分子机制尚不清楚,本研究引入SWATH非标记定量蛋白质组学技术,对蛹虫草Cordyceps militaris 905菌株的菌丝体（mycelium,My）、原基（primordium,Po）、生长期子实体（developmental fruiting body,DF）和成熟期子实体（mature fruiting body,MF）进行了比较蛋白质组学分析。经搜库比对,从蛹虫草的My、Po、DF和MF中依次鉴定蛋白1 136个、1 090个、1 018个和997个（global FDR 1%）,经维恩分析后获得C. militaris 905蛹虫草表达蛋白1 578个。在此基础上,SWATH非标记技术定量蛋白1 109个。本研究获得了蛹虫草Po期与My期、DF期与Po期、MF期与DF期的差异表达蛋白,依次为115个、352个和104个,并对菌丝体分化形成原基的差异表达蛋白进行了重点解析。GO注释结果表明,Po期与My期差异表达蛋白以有机含氮类化合物代谢为主,其中AMP（活性成分虫草素合成的中间产物）从头生物合成途径富集最为显著。约1/5的差异表达蛋白参与氧化还原反应,还原酶活性的蛋白在原基中几乎都上调表达,而氧化功能的蛋白受到抑制,表明蛹虫草原基分化可能受到氧化应激的诱导。蛋白互作网络分析结果进一步表明,氧化还原反应与核苷类物质代谢相关联,可能通过影响AMP从头生物合成途径来调控虫草素的生物合成。对蛹虫草子实体系统的蛋白质组学研究和解析有利于揭示子实体形成的蛋白分子机制,为蛹虫草的基础和栽培研究提供了理论支撑。
在大型真菌原基形成和子实体发育的过程中,温度是一个极其关键的因素,高温显著影响多种食用菌原基的形成和子实体的品质。广东虫草是中国华南地区特有的虫草类新食品原料,其子实体富含多种活性成分和营养成分,且能够进行较大规模人工栽培。然而,温度对广东虫草原基形成的影响及调控机制尚不清楚。本研究通过不同温度处理不同时间段,发现29℃处理3d抑制了广东虫草原基的形成;对29℃处理3d处理前后的菌丝阶段（CK）和原基阶段（CK-P和HT-P）样品进行转录组测序分析,高温处理后原基阶段的两个组中发现1 682个差异表达基因,其中1 015个上调表达和667个下调表达。在碳水化合物代谢途径中,多个糖酵解和三羧酸循环及葡聚糖和海藻糖合成相关基因在高温处理后呈现下调表达;在原基样品中,多个热激蛋白基因（Hsp10、Hsp23、DnaJ、Hsp70、Hsp90和Hsp98）和转录因子C2H2转录水平显著上调表达。本研究结果基于分子水平揭示了高温影响原基形成过程中能量代谢和相关基因的差异表达,为后续利用广东虫草抗逆相关基因资源培育新品种奠定了重要的基础。
蓝光是影响生物生长发育过程的重要因素,同时生物个体的生长发育过程中不断有蛋白质的泛素化降解。采用蓝光和蛋白酶体抑制剂MG132处理蛹虫草菌,观察蛹虫草菌落、菌丝体和子实体形态的变化。研究结果表明,黑暗条件下正常生长的菌落边缘圆滑一致,菌落之间融合无边界;MG132处理后,菌落之间出现明显的界限,边缘菌丝稀疏。蓝光条件下无MG132处理时,菌落较为单薄,转色明显;MG132处理时,菌落中间橙色,边缘颜色变淡。扫描电镜观察,黑暗条件下无MG132处理的菌丝自然弯曲,菌丝表面较为光滑,菌丝粗细差别不大且分枝较少,分生孢子表面较光滑。黑暗条件下MG132处理菌丝体,菌丝较直且分枝较多,菌丝容易断裂,分生孢子表面仍较光滑。蓝光条件下菌丝体弯曲减少,菌丝表面较为粗糙,单条菌丝常出现部分区段膨大呈不规则状,菌丝粗细差异较大,菌丝断裂较多;分生孢子呈扁平的椭圆状,表面有纹理,且粗糙。蓝光条件下MG132处理的菌丝体,菌丝较直,表面粗糙,菌丝整体变得更细,菌丝断裂较多;分生孢子呈不规则形状,表面纹理更深,粗糙有褶皱。此外,MG132可导致蛹虫草子实体畸形生长。结果表明,蓝光和MG132均可以影响蛹虫草的形态变化。
蛹虫草规模化栽培过程中,真菌病害普遍发生且危害严重。本研究对人工栽培蛹虫草中真菌病害进行调研,对病原真菌进行分离、纯化、鉴定及致病性检验,并分析病害发生的特点。结果发现引起蛹虫草病害的病原真菌主要有虫草生齿梗孢、产扁虫菌素单端孢、镰刀菌、裂褶菌、哈茨木霉、淡紫拟青霉、稻绿核菌、粉红枝穗霉、卵孢单端孢、扩展青霉、黄曲霉和黑曲霉。其中虫草生齿梗孢为引起蛹虫草侵染性病害的主要病原真菌。虫草生齿梗孢、产扁虫菌素单端孢、镰刀菌、裂褶菌和哈茨木霉主要为害蛹虫草子实体;淡紫拟青霉、稻绿核菌、粉红枝穗霉、卵孢单端孢、扩展青霉、黄曲霉和黑曲霉主要为害栽培料与蛹虫草菌丝体。镰刀菌、裂褶菌、哈茨木霉、淡紫拟青霉、稻绿核菌和粉红枝穗霉为引起蛹虫草病害的首次报道。本研究为蛹虫草病害防控奠定基础,以促进产业健康发展。
以采集自泰山地区的6株野生蛹虫草为研究对象,分别通过菌核、子座组织分离和子囊孢子分离法共获得18个菌株,经ITS鉴定均为蛹虫草菌株后,进一步对18个菌株进行了菌丝生长速度、菌落形态、出草试验、主要活性物质（虫草素、腺苷、虫草多糖、β-类胡萝卜素、叶黄素）和交配型的测定分析。结果表明：在菌丝长势、出草产量和整齐度方面,从子囊孢子分离得到的菌株普遍优于组织分离菌株;而在活性物质含量方面,从子囊孢子和子座分离得到的菌株普遍优于菌核分离菌株。通过交配型测定发现,从菌核、子座和子囊孢子分离得到的18个菌株均不存在交配型缺失现象。
为了探究冬虫夏草治疗肾纤维化的分子机制,本研究运用网络药理学方法筛选出冬虫夏草抗肾纤维化的活性成分、潜在作用靶点及相关信号通路,并对关键的化合物和靶点进行分子对接。结果表明,冬虫夏草共有22个化合物和364个潜在靶点参与治疗肾纤维化,蛋白互作（PPI）分析出IL-6、TNF-α、MAPK3、EGFR、SRC、CASP3和MAPK1等关键潜在靶点,KEGG通路富集筛选得到163条信号通路。分子对接结果显示,冬虫夏草治疗肾纤维化过程中,其核心化合物金色酰胺醇酯、啤酒甾醇、酒渣碱、花生四烯酸、11,14-二十碳二烯酸分别与PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、MAPK1、MAPK3、RELA等具有良好的结合性能。分析结果显示,冬虫夏草具有通过多成分、多靶点、多通路减缓肾纤维化的潜力,为其抗肾纤维化临床使用提供了一定的依据。
研究了虫草素联合阿霉素在体外抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及转移作用,评估了联合用药的作用效应,为虫草素在临床应用上增强抗乳腺癌作用提供了科学数据。研究结果表明,联合用药比单独用药作用效果更明显,根据Chou-Talalay法显示出在80μmol/L虫草素联合1μmol/L阿霉素的条件下,联合用药协同作用最优,CI值为0.665,细胞抑制率达到60.31%±1.06%;与对照组相比,平板克隆形成实验证明联合用药显著抑制细胞增殖,克隆形成率仅为7.03%±1.19%;显微观察细胞形态变化表明联合用药明显影响细胞生长;Hochest 33258染色、DNA Ladder发现联合用药对细胞凋亡诱导作用更显著,细胞凋亡率可达78.52%±11.18%;细胞划痕愈合实验检测联合用药显著抑制细胞迁移,细胞迁移率仅为18.82%±2.43%。本研究确证虫草素可协助阿霉素治疗乳腺癌的增敏作用。
建立九州虫草-半枝莲双向固体发酵产物不同极性部位的HPLC特征图谱,并考察与其抑制肺腺癌A549细胞增殖活性的相关性。采用双向固体发酵技术制备九州虫草-半枝莲发酵产物;溶剂萃取法获得发酵产物的不同极性部位,并运用HPLC法建立不同极性部位的特征图谱;MTT法考察不同极性部位对A549细胞的增殖抑制作用;偏最小二乘回归法分析不同极性部位HPLC色谱峰与其抗增殖作用的相关性。抗增殖试验结果表明,不同极性部位对A549细胞均具有增殖抑制作用并且呈浓度依赖性;标示的9个共有色谱峰与抗增殖活性均呈正相关,其中色谱峰8、4、1、2、9分别为木犀草素、黄芩苷、对香豆酸、野黄芩苷、黄芩素。本研究建立了不同极性部位的HPLC特征图谱,极性部位中以二氯甲烷部位对A549细胞的体外抗增殖作用最佳,并借助谱效相关初步探究了发酵产物抗A549细胞增殖的药效物质基础,为双向固体发酵技术应用于菌种与传统中药提供了参考。
采用麦粒（W）、麦粒加蚕蛹粉（WW）、大米（R）、大米加蚕蛹粉（RW）的配料栽培方式,以及蚕蛹（CY）活体接种栽培方式培养蛹虫草子实体,比较蛹虫草子实体中多糖及核苷、游离糖醇和小分子糖类含量。结果表明：培养基和栽培方式影响蛹虫草多糖含量及其单糖组成和分子量分布,多糖含量最高的为蚕蛹活体接种培养的处理（CY）,多糖含量为6.19%,其他处理的多糖含量仅为CY的44.4%-62.8%;蚕蛹（CY）上培养的蛹虫草子实体中核苷类成分含量最高,在麦粒上培养获得的子实体中核苷含量显著高于在大米上的处理,并且麦粒添加蚕蛹粉后培养的子实体中尿苷、鸟苷、N6-(2-羟乙基)腺苷含量显著上升,大米添加蚕蛹粉后培养的子实体中尿苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷含量显著上升;配料栽培的4个处理,其子实体中海藻糖含量为20.07%-23.40%,蚕蛹活体接种的处理（CY）海藻糖含量显著降低,为8.41%;添加蚕蛹粉后子实体中甘露醇含量显著降低。对各成分含量的数据进行归一化处理后进行蛹虫草品质的综合评价,在蚕蛹上培养的蛹虫草综合评分最高,麦粒为主要培养基培养的蛹虫草品质好于大米为主要培养基的,且添加蚕蛹粉的处理优于未添加的处理。
蛹虫草是重要的食药用真菌,虫草素为其主要活性成分,在抗肿瘤、抗菌、降血糖等方面具有较为突出的功效。蛹虫草菌株间的形态及环境条件差异,对菌株次级代谢产物虫草素产生影响显著。本研究对不同来源的6株蛹虫草菌株（YCC-B、YCC-C、YCC-H、YCC-W、YCC-Y、CGMCC 3.4655）,从蚕蛹体培养子实体性状,液体发酵条件（培养天数、培养方式、外源金属离子等）和传代稳定性等方面筛选优良性状菌株,提高其发酵合成虫草素的能力及稳定性。结果表明,蛹虫草菌株YCC-W在蚕蛹子实体出草及菌体液体发酵产虫草素上综合表现优良,传代稳定;液体发酵培养基中添加外源金属离子Mn2+作为酶的辅基,可以促进虫草素合成;采用振荡-静置相结合的混合发酵培养方式,可以避免单纯振荡培养溶氧量大、菌丝体生长旺盛,而虫草素产生不佳的问题。先振荡培养3d后静置培养至25d时,菌株YCC-W合成虫草素含量最高,可达(874.13±24.25)μg/mL,且稳定性良好。为进一步开发菌种及扩大规模生产提供参考。
