蛛生真菌（araneogenous or araneopathogenic fungi）是一类对蜘蛛具有致病性的真菌（
Evans & Samson 1987）。由于其特殊的营养偏好及独特的寄主,赋予了其与众不同的代谢产物。研究报道,蛛生真菌具有抑制真菌和细菌的活性物质（
Kladwang et al. 1998;
Lee et al. 2005;
Kuephadungphan et al. 2014;
Bunbamrung et al. 2015）,并且从中发现了许多新的物质,如环肽类（Lang
et al. 2005）,麦角固醇及其类似物（
Asai et al. 2012）和生物碱 类（
Isaka et al. 2010,
2013）,特别是发现的一类具良好生物相容性物质尤其引人关注（Madla
et al. 2005）。
蛛生真菌已发现于肉座菌目、广义麦角菌科中的虫草属
Cordyceps sensu lato（Sung
et al. 2007）、虫壳属
Torrubiella Boud.（
Evans & Samson 1987）以及无性型真菌中的刺束梗孢属
Akanthomyces Lebert,
Clathroconium Samson & H.C. Evans、糙梗孢属
Granulomanus de Hoog & Samson、被毛孢属
Hirsutella Pat.、层束梗孢属
Hymenostilbe Petch、棒束孢属
Isaria Pers.、蜡蚧菌属
Lecanicillium W. Gams & Zare、野村菌属
Nomuraea Maubl.和球束梗孢属
Gibellula Cavara等（
Evans 2013）。但在枝穗霉属
Clonostachys Corda中则未见报道。
枝穗霉属
Clonostachys Corda是Corda于1839年以
Clonostachys araucaria Corda作为模式种所建立的。目前,该属的多数成员是由他属转属而来。Schroers（2001）通过TUB和ITS位点对生赤壳属及其无性型枝穗霉属进行了整理,去掉一些同物异名和无效种后,共报道了43个种。此后,又有新种不断被报道（
Hirooka & Kobayashi 2007;
Rossman 2014）。Lombard
et al.（2015）利用10个位点在属级水平进行研究,将其他属的8个种组合到了枝穗霉属,但在种的鉴定上,传统上仍使用TUB和ITS两个位点（
Schoch et al. 2001;
Hirooka & Kobayashi 2007;
Abreu et al. 2014）。根据Index fungorum的最新统计（http://www.indexfungorum.org/Names/Names.asp）,目前该属记载报道的分类单元共有75个。
枝穗霉属的大多数种腐生,重寄生于真菌、地衣或栖居于死亡不久的树木及腐烂的树叶上,极少发现寄生黏菌、线虫、扁虱、软体动物或卵菌等（
Schroers 2001）。作为真菌的重寄生菌,粉红枝穗霉
Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams已作为生物防治菌防治植物病原菌（
Jensen et al. 2004;
Kosawang et al. 2014;
Mouekouba et al. 2013）。Toledo
et al.（2006）报道了粉红枝穗霉可寄生
Oncometopia tucumana Schröder和
Sonesimia grossa Signoret等昆虫。
2013年,我们在对我国束梗孢类虫生真菌资源调查中,从贵阳市黔灵山公园采集得到一种寄生于蜘蛛且产生孢梗束的标本,通过对模式标本GZAC QLS0625及从标本分离培养获得菌株QLS0625clo产孢结构的观察,并结合分子系统学及系统发育网络研究发现,标本GZAC QLS0625为枝穗霉属一新种,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本：采自贵州省贵阳市黔灵山公园（北纬26°6’,东经106°6’）,寄主为蜘蛛,标本编号GZAC QLS0625,采集人陈万浩,采集时间2013年6月,菌株编号QLS0625clo。标本保存于贵州大学真菌资源研究所（GZUIFR）,菌株保存于虫草及相关真菌资源保藏中心（GZAC）。
1.1.2 PDA培养基：马铃薯200g切块,煮沸30min,过滤取汁,加葡萄糖20g,水补足1 000mL,pH自然,121℃灭菌30min,凝固前加入链霉素（≈40单位/mL）和青霉素（≈40单位/mL）,倒平板备用。
1.1.3 棉蓝染色液：苯胺蓝0.025g,乳酸10g,石炭酸10g,甘油20g,蒸馏水10mL。配制完后用双层擦镜纸过滤后备用。
1.2 方法
1.2.1菌株分离、培养与形态观察：用无菌镊子截取小段孢梗束产孢区放入到加有抗生素的PDA平板上,（25±1）℃培养3d,镜检后保存单菌落菌株。将分离的菌株接种到未加抗生素的PDA平板上,（25±1）℃培养14d,用透明胶带黏取菌落边缘具产孢结构的菌丝制片,然后置于显微镜下进行微观产孢结构的形态观察。
1.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序：DNA提取：在PDA平板上,用无菌刀片刮取菌落上的菌丝及取干净的孢梗束,用液氮进行研磨后,按照DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]植物基因组流程进行DNA的提取。
PCR扩增：ITS位点扩增采用引物ITS4和ITS5（
罗韵等 2016）,TUB位点采用Bt2a和Bt2b（
Glass & Donaldson 1995）。反应体系及条件均与上述文献相同。扩增后的产物检测参见罗韵等（2016）的方法。
PCR产物纯化和DNA测序：样品经纯化和测序[天根生化科技（北京）有限公司]获得的序列,经手工校对后,于GenBank进行比对和注册序列号（标本和菌株的ITS和TUB的GenBank登录号分别为：KT895417,KU173835;KU212400-KU212401）。
1.2.3 序列比对和系统发育分析：将供试标本序列于GenBank中进行Blast比对,分别下载相似性大于90%的近缘属菌株的ITS1-5.8S-ITS2序列,并以大丽轮枝菌
Verticillium dahlia Kleb.为外群,经MAFFT v7.037b（
Katoh & Standley 2013）进行序列比对及手工校正后,ITS-TUB采用SequenceMatrix1.7.8 软件进行拼接（
Vaidya et al. 2011）,并运用PAUP4.0b10（
Swofford 2002）软件进行同质性检验,最后以MEGA5.2软件中的最大简约法（MP）构建系统发育树（
Tamura et al. 2011）。通过SplitsTree4（http://www.splitstree.org）软件进行发育网络分析,运行程序为：
P-distance、Unrooted Neighor Net。
2 结果与分析
2.1 形态特征描述及鉴定
Clonostachys aranearum W.H. Chen, Y.F. Han, J.D.Liang, X. Zou, Z.Q. Liang & D.C. Jin sp. nov.
Fig. 1
MycoBank MB 814797
Infected spider host covered with dense mycelial mat, white, pulvinate, tomentose. Hyphae branched, septate, hyaline, smooth. Synnemata solitary, arising from mycelial mat, cylindrical, attenuated, consisting of compacted septate longitudinal hyphae, hyaline, smooth, 0.05-0.14cm long, 63.2-168.4μm wide. Conidiophores verticilium-like, cylindrical phialides divergent in whorls of 2-5 or single from lower levels, generally slightly tapering towards the tip, 15.8-23.8×1.3-2.5μm. Conidia smooth-walled, hyaline, ellipsoid, mostly curved, 4.1-5.2×2.2-3.2μm.
图1 蛛生枝穗霉Clonostachys aranearum A：被感染的蜘蛛;B：放大的孢梗束;C,D,J：A型产孢结构;E：人工培养基上的B型产孢结构;F：人工培养基上的菌落;G：人工培养基上的A型产孢结构;H：人工培养基上产生的分生孢子;I：分生孢子. 标尺：A=0.1cm;B=200μm;C-E,G-J=10μm;F=1cm.Fig. 1 Clonostachys aranearum. A: Infected spider; B: Magnified synnemata; C, D, J: A-conidiophores; E: B-conidiophores on the artificial medium; F: Colony on the artificial medium; G: A-conidiophores on the artificial medium; H: Conidia on the artificial medium; I: Conidia. Bars: A=0.1cm; B=200μm; C-E, G-J=10μm; F=1cm. |
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Colonies reaching 45mm diam. in 7d at 25°C; White, radially sulcate from the agar surface, untidy at the margin, aerial hyphae short villiform. Reverse fawn. Conidiophores dimorphic, arising from aerial hyphae. Primary conidiophores verticilium-like, formed throughout the colony, dominating towards the margin, arising from the agar surface. Cylindrical phialides divergent in whorls of 2-5 or single from lower levels, generally slightly tapering towards the tip, 17.3-27×1.1-1.6μm, each producing a hyaline drop of conidia. Secondary conidiophores penicillium-like, single or aggregated but not sporodochinal. Phialide divergent, with a whorl of 3-5, 5.4-16.2×1.1-2.2μm, narrow cuneate, generally slightly tapering towards the tip. Conidia smooth-walled, hyaline, ellipsoid, 3.2-5.4×1.1-2.1μm, mostly curved, with an unconspicuous hilum. Conidia of imbricate chains or column form arrangement.
Etymology: The species is named after the host.
Host: A species of spider.
Locality: Qianlingshan Park, Guiyang, Guizhou Province, China.
蜘蛛被覆白色菌丝层,菌丝分枝,分隔,透明,光滑。孢梗束单生,从寄主体表菌丝层长出,圆柱形,渐狭,由壁光滑的平行菌丝组成,透明,长0.05-0.14cm,宽63.2-168.4μm。分生孢子梗为轮枝菌型,单轮或多层轮生,瓶梗通常2-5个形成轮生体,圆柱形,至顶端略微变细,15.8-23.8×1.3-2.5μm,分生孢子表面光滑,透明,椭圆形,常弯曲,4.1-5.2×2.2-3.2μm。
25℃,在PDA培养基上培养7d菌落直径可达4.5cm,菌落颜色为白色,表面可见放射状沟纹,边缘不规则,气生菌丝明显,短绒毛状,菌落背面呈淡黄褐色。产孢结构呈二型,着生于气生菌丝上。A型：轮枝菌型,单轮或多层轮生,瓶梗通常2-5个形成轮生体,圆柱形,至顶端略微变细,17.3-27×1.1-1.6μm;B型：帚状,单生或聚生,具散生的分枝,通常3-5个瓶梗形成轮生体,5.4-16.2×1.1-2.2μm,窄楔形,渐细。大量产孢时,分生孢子叠瓦状排列形成柱形。分生孢子表面光滑,透明,3.2-5.4×1.1-2.1μm,椭圆形,常弯曲。脐出现在侧面,通常不明显。
Ex-type：菌株QLS0625clo,除未见B型产孢结构外,其他特征与主模式基本一致。
模式标本：GZAC QLS0625（主模式）。模式标本保存于贵州大学真菌资源研究所虫草及相关真菌资源保藏中心（GZAC）。
词源学：aranearum,指寄主蜘蛛。
寄主：一种蜘蛛。
分布：贵州省,贵阳市,黔灵山公园。
枝穗霉属中,PDA培养基上菌落颜色为白色,且分生孢子梗呈类轮枝菌和类青霉两型共有4个种,即Clonostachys macrospora (Sacc. & Ellis) Schroers & W. Gams、Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams、Clonostachys rhizophaga Schroers和Clonostachys grammicosporopsis Schroers & Samuels。而蛛生枝穗霉可通过寄主为蜘蛛,及较小的分生孢子（3.2-5.4×1.1-2.1μm）与上述相近种相区别。
2.2 系统发育分析
基于ITS-TUB 基因位点和单基因ITS位点序列,以MEGA软件的最大简约法（MP）构建系统发育树[一致性指数（CI）分别为0.82,0.91;保持性指数（RI）分别为0.67,0.83]。两棵树图都显示,GZAC QLS0625及其培养分离菌株QLS0625clo以其独立分枝与其密切相近的
Clonostachys rhizophaga Schroers、
Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams、
Clonostachys agarwalii (Kushwaha) Schroers、
Clonostachys pseudochroleuca Schroers和
Clonostachys solani (Harting) Schroers & W. Gams相分离（
图2）。但无论是单基因或多基因构建的系统发育树中,支持率都不很高,且在ITS-TUB组合序列构建的树图中尚有长枝现象。为进一步确证系统发育解析结果的可靠性,我们对建树用数据集进行了系统发育网络分析。
图2 基于ITS-TUB 基因位点和单基因ITS位点序列 用MEGA5.2软件构建的最大简约法（MP）系统发育树. 节点上的数据只显示高于50%支持率的值.Fig. 2 Phylogenetic tree based on the ITS-TUB and ITS sequences and maximum parsimony method by MEGA5.2. Statistical support values (>50%) are shown at nodes. |
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2.3 系统发育网络分析
形态学、ITS-TUB多基因位点和单基因ITS位点序列系统发育分析已初步探明了研究标本的系统发育地位,为进一步探讨在系统发育分析中结果的真实性,我们进行了邻接网络（neighbor-net）的构建和分析。我们构建的网络图的拓扑结构（
图3）,与系统发育树的基本一致,这表明可用于进一步分析（
Huson & Bryant 2006）。在拆分网络图中,包括研究的标本在内（除外群外）,可拆分为5个相应类群。其中,枝穗霉属大多数成员的矛盾冲突较小,以较少的拆分聚集在网络图的基部。研究标本GZAC QLS0625及QLS0625clo 经多次拆分,仍独立聚在一起,与其相近的类群相区别。此外,GZAC QLS0625以长枝出现,也并未将其他分类单元吸引,而产生虚假的进化分枝。邻接网络拆分结果支持了形态特征鉴定和系统发育分析结果的可靠性。
图3 用来自构建系统发育树的序列资料（图2）重建的邻接网络拆分图Fig. 3 A neighbor net splits graph based on the original data of Fig. 2. |
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3 讨论
目前,在GenBank中大约有172 000条全长的ITS序列（Schoch
et al. 2011）。国际上的多个实验室,对可作为真菌条形码的DNA片段的评估结果也表明：ITS是识别大多数真菌成功概率最高的序列（Schoch
et al. 2011）。真菌rDNA ITS序列在种的鉴定和识别上的确具有明显的实用价值。目前在枝穗霉属中,相关分子系统学的研究主要采用ITS和TUB两个位点（
Schoch et al. 2001;
Hirooka & Kobayashi 2007;
Abreu et al. 2014）。为利于我们研究的标本和属内已发表的种进行比较,我们仍采用上述两个位点序列进行分析。
系统发育网络分析常采用拆分网络（splits networks）法（
Huson & Kloepper 2005）。在系统发育分析中,常因生物学冲突（如用不同基因或片段产生的不兼容树,可由一个和多个分子过程所引起）或推论误差（如取样数量少,进化速率上差异太大的分类单元,亲缘远的外群;由于实验误差及意外事故获得的数据;分析时指定的模型不对）等造成长枝和网状结构（
Morrison 2011）。在本研究中,我们采用ITS位点和ITS-TUB联合分析构建的二叉系统发育树出现了拓扑结构的差异,主要是它们隐含和掩盖了上述诸多因素造成的网状结构的结果,而以拓扑结构的不一致性和低支持率等现象显示（
Morrison 2005,
2011;
Huson & Bryant 2006;
Morozov et al. 2013）。在拆分网络解析中,直观观察到的GZAC QLS0625及QLS0625clo与其相邻类群间的多网状结构,就帮助我们理解和揭示了系统发育树中的拓扑结构差异,及出现低支持率的分枝现象出现可能的原因：从GenBank数据库下载序列的生物学冲突,或分析过程中推论误差等因素（
Huson & Bryant 2006）。
长枝（long branch）常见于分子系统发育树中。在被试的数据集中,快速进化的分类单元常造成长枝。其他方面,使用了不当的或亲缘关系过远的分类元作为外群;或数据集中存在趋同、平行等进化特征等,在程序分析时误认为是共源性状（synapomorphies）,而将这类非真实姐妹关系的分类元错误地聚在一起,造成“长枝吸引”假象（
Bergsten 2005;
黎一苇等 2007;
Morrison 2011）。我们近期的研究结果发现,重组事件是系统发育树中长枝出现的另一类重要因素（待发表）。如前所示,我们用邻接网络（
图3）分析的GZAC QLS0625长枝并无长枝吸引假象,但是通过重组软件RDP4.5分析的结果（未展示）显示,标本GZAC QLS0625可能存在重组事件。
形态学与ITS序列、ITS-TUB序列联合分析及拆分网络解析,都支持蛛生枝穗霉Clonostachys aranearum为枝穗霉属的一新种。
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图1 蛛生枝穗霉Clonostachys aranearum A：被感染的蜘蛛;B：放大的孢梗束;C,D,J：A型产孢结构;E：人工培养基上的B型产孢结构;F：人工培养基上的菌落;G：人工培养基上的A型产孢结构;H：人工培养基上产生的分生孢子;I：分生孢子. 标尺：A=0.1cm;B=200μm;C-E,G-J=10μm;F=1cm.
