2021年6月,广西南宁一紫芝培养基地出现疑似蛛网病危害。为明确引起紫芝蛛网病的病原菌,采用组织分离法对病样进行分离纯化,利用多位点基因(ITS,RPB2,TEF1)系统发育学分析、形态学特征观察和致病性测定对分离纯化后的菌株进行鉴定,并开展病原菌的生物学特性研究。明确引起广西南宁紫芝蛛网病的病原菌为凸出枝葡霉Cladobotryum protrusum。该菌菌丝生长的最适培养基为PDA,最佳碳、氮源分别为可溶性淀粉和酵母粉,最适生长温度为25 ℃,pH为6,黑暗有利于菌丝生长。这是首次报道由C. protrusum引起的紫芝蛛网病。
纽芬兰鸡油菌是北美东部一种深受欢迎的美味食用菌。火烧山,位于加拿大格罗莫恩国家公园中心、三面环水,该地纽芬兰鸡油菌的持续出菇时间至少可追溯至20世纪60年代且未见于周边地区。研究该持续存在的孤立种群,对于资源保护和开发具有重要意义。本研究在火烧山共采集纽芬兰鸡油菌子实体109个,包括间距100 m以上的6个局域群体共81个个体以及5 d后随机采集的28个个体。基于微卫星标记的基因分型结果显示,3个位点上分别有3、5和2个等位基因,而每个局域群体的各位点均被1到2个等位基因主导;共有多位点基因型29个。每个局域群体和总样本中的基因型频率总体上符合哈迪-温伯格平衡。虽然总样本中存在显著的遗传分化,但克隆校正后未检测到差异。比较间隔5 d的两次取样,等位基因和基因型频率存在微小差异。此外,与纽芬兰岛另外两地(分别相距约200 km和600 km)和安大略省哈密尔顿市一地(约2 000 km外)共3个地区群体样本进行了比较。结果表明,突变、有性生殖、基因流、选择和遗传漂变都对纽芬兰鸡油菌种群的遗传多样性产生了影响。
茯苓Wolfiporia hoelen是一种食药兼用的大型真菌,在我国栽培历史悠久,但由于长期无性繁殖,导致菌种退化,栽培产量下降,严重影响产业发展。为解决茯苓育种的难题,我们前期建立了茯苓同核体鉴定方法,明确了其交配系统,建立了单孢同核体杂交育种体系,但是部分茯苓菌株子实体形成困难或子实体贴生,导致担孢子收集困难,因此原生质体单核化的研究具有重要意义。本研究以两株存在较大遗传差异且同核体类型不同的菌株776和775为材料,核荧光染色表明超过60%的原生质体具有细胞核,原生质体再生率分别为11.0%和7.6%,不易生长的再生菌株中既有同核也有异核菌株。原生质体单核化获得了两个菌株的同核体菌株,比例可达到10%以上,菌株776获得了两种交配型的同核体菌株(5:3),不存在偏分离(χ2=0.5),但菌株775原生质体单核化仅获得了一种交配型的同核体菌株,表现出严重的交配型偏分离。通过杂交菌株与两亲本对峙试验及基于rpb2的杂合位点验证,证实获得了原生质体同核体杂交菌株25株,原生质体同核体与单孢同核体杂交菌株50株,表明茯苓原生质体同核体杂交育种的可行性。
中国树花是广布于北半球的一种地衣,具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎和治疗糖尿病等生物活性。本研究首次对中国树花Ramalina sinensis的线粒体基因组进行测序、组装和注释,结果表明其线粒体基因组是一个长度为38 265 bp的环状分子,共编码42个基因(15个蛋白质编码基因(PCGs)、2个rRNA基因和25个tRNA基因),碱基组成具有明显AT偏好性,其中24个tRNA被成功预测为典型三叶草结构。密码子偏好性分析显示该线粒体基因组对A/U结尾的密码子具有明显偏好性。树花科地衣共线性分析没有发现大面积的基因重排现象。与间枝树花R. intermedia的线粒体基因组比较分析显示这2个物种有着较为亲密的适应性进化关系。15个PCGs的Ka/Ks值各不相同,说明这些基因正在接受不同的选择压力。系统发育分析表明中国树花与间枝树花的亲缘关系很紧密。本研究为树花属的资源保护、系统进化以及遗传多样性研究提供基础数据。
为了解3种侧耳属真菌基因组密码子的使用偏性及影响因素,本研究以糙皮侧耳、刺芹侧耳和白灵侧耳基因组CDS序列为研究对象,通过生物信息学方法对3种侧耳密码子使用偏性进行了分析。结果表明,3种侧耳基因组总碱基组成差异小,GC含量高。RSCU、RFSC分析表明糙皮侧耳G/C结尾的偏好密码子的比例最高(82.14%),并且有3个特有偏好密码子。3种侧耳共有偏好密码子25个,以G/C结尾的占80%;共有高频密码子3个,均以G/C结尾。密码子相似性分析表明3种侧耳密码子使用模式比较相似(相似性指数均小于0.001),其中刺芹侧耳与白灵侧耳的相似性最高(相似性指数为0.000 259 014);且3种侧耳密码子的使用频率与灰盖鬼伞和金针菇较为接近。PR2-plot、ENc-GC3和中性绘图分析表明3种侧耳密码子偏好性使用主要受自然选择影响,在一定程度上也受碱基突变压力和其他因素影响。上述结论为分析侧耳真菌的进化规律及选择最佳异源表达受体系统提供了依据。
本研究以皱环球盖菇Stropharia rugosoannulata不同发育时期(菌丝期、原基期、幼菇期、小菇期、成熟期)、不同组织部位(菌盖、菌柄、菌褶)和不同颜色菌盖(红色、黄色、白色)为试验材料,选择10个内参基因(ACT、GAPDH、TEF、RPL4、PGI、PGM、RPB2、β-TUB、α-TUB、UBQ)并设计跨内含子的引物,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术进行扩增,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法进行表达稳定性分析以及综合评价算法ReFinder进行加权评比,最终筛选适宜各类样本的内参基因。根据内参基因稳定性的最终排名,最适宜作为不同颜色菌盖内参基因的组合是UBQ和GAPDH,最不适宜的是ACT、PGI和TEF;最适宜作为子实体不同组织部位内参基因的组合是UBQ和RPB2,最不适宜的是ACT、RPL4和TEF;最适宜作为不同发育时期内参基因的组合是ACT和RPB2,最不适宜的是GAPDH、α-TUB和β-TUB。
外生菌根真菌(ectomycorrhizal fungi, ECMF)可广泛与林木建立共生关系,促进林木对土壤磷的吸收。然而,不同菌种或菌株溶解不同磷源的能力不同,且影响菌株或菌种溶磷能力的生理因素尚不清楚。因此,本研究以从板栗Castanea mollissima和锥栗C. henryi林下采集的真菌子实体进行分离纯化及ITS序列的同源性分子鉴定所获得的5个菌株,和前期课题组获得的土生空团菌Cenococcum geophilum (CG)为研究对象,将其在以难溶性有机磷(植酸钙C6H6Ca6O24P6、卵磷脂C42H80NO8P)和难溶性无机磷(磷酸铝AlPO4、磷酸铁FePO4)为磷源的蒙塔纳(Montana)培养基中进行培养,测定6个ECMF菌株在纯培养条件下的菌落直径、菌丝干质量、溶磷率、酸性磷酸酶活性、pH值、柠檬酸和草酸含量,分析在不同难溶性磷源下各菌株的生长及溶磷特性;并运用皮尔逊相关性分析,探讨不同难溶性磷源下影响菌株溶磷率的主要生理因素。结果表明:(1) 6个ECMF菌株在不同难溶性磷下生长速率差异显著(P<0.05)。橙黄硬皮马勃Scleroderma citrinum (LY-20-2)在磷酸铝条件生长最快,中华豆马勃Pisolithus orientalis (LY-8)在其他3种难溶性磷源下生长均最快。(2) 6个ECMF菌株对4种难溶性磷的溶磷能力具有显著差异(P<0.05)。以植酸钙为磷源时,LY-8溶磷率最高,达28.9%;以卵磷脂和磷酸铁为磷源时,LY-20-2的溶磷率最高,分别为3.2%和4.6%;以磷酸铝为磷源时,CG的溶磷率最高,达3.2%。(3) 在4种难溶性磷源下,各菌株发酵液中的pH值均降低。以卵磷脂和磷酸铁为磷源时,除马勃Scleroderma sp. 2 (MB)以外,其他菌株均未分泌草酸。(4) 以植酸钙为磷源时,菌落直径、菌丝干质量、酸性磷酸酶活性和草酸含量均与菌株溶磷率呈显著正相关(r=0.61-0.88);以卵磷脂为磷源时,菌落直径和酸性磷酸酶活性与菌株溶磷率呈显著正相关(r=0.50-0.95);以磷酸铝为磷源时,溶磷率与柠檬酸呈显著正相关(r=0.55);以磷酸铁为磷源时,溶磷率与柠檬酸含量没有显著相关性(r=0.44);在4种难溶性磷源下,溶磷率与pH值均呈极显著负相关关系(r=−0.88-−0.70)。以上结果表明,栗林下的ECMF菌株对难溶性有机磷植酸钙的利用潜力高于卵磷脂和难溶性无机磷磷酸铝、磷酸铁。ECMF针对不同难溶性磷源采取了不同的溶磷策略,包括调控生长速度和分泌不同种类的有机酸。
通过气相色谱-离子迁移谱技术(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)对2个香菇品种的不同菌龄的重要农艺性状和挥发性有机物的差异进行了研究。研究表明:不同菌龄阶段的香菇只在产量和蕾数上有显著差异,同等菌龄、不同香菇品种间农艺性状差异显著。2个香菇品种分别鉴定出包括单体和二聚体在内的17和12种挥发性物质,包括醛类、酯类、醇类、酮类、酸类和烯类化合物。基于化学计量学主成分分析(principal component analysis,PCA)、指纹图谱和聚类分析对2个香菇品种的不同菌龄挥发性有机物分析发现,不同菌龄的香菇中挥发性有机物质有较大差异,不同香菇品种中挥发性有机物质也呈现一定的差异,菌龄为95 d和105 d时挥发性有机物均较为相似。2个香菇品种中柠檬烯均是随着菌龄的增加逐步上升,乙酸乙酯和壬醛均是逐步降低。此外,3-甲基丁醇、戊醛、庚醛、己醛和柠檬烯可作为区别“申香1513”不同菌龄阶段的特征挥发性有机物,丁酸乙酯和柠檬烯则可作为区别“5550”不同菌龄阶段的特征挥发性有机物。GC-IMS可快速对不同菌龄的香菇品种进行挥发性化合物的差异分析,为香菇挥发性成分差异研究和品质育种提供参考依据。
对亚洲兰茂牛肝菌Lanmaoa asiatica (“见手青”)的化学成分和生物活性进行研究。采用多种柱色谱技术以及重结晶等方式对其95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物进行分离纯化,共得到17个单体化合物。根据波谱数据及文献比对鉴定了化合物的结构,其中9个为甾体类化合物:citreoanthrasteroid (1)、1(10→6)abeo-麦角甾-5,7,9,22-四烯-11β-甲氧基-3α-醇(2)、3β,5α,9α-trihydroxy- 6β-methoxyergosta-7,22-dien (3)、过氧化麦角甾醇(4)、9(11)-去氢过氧化麦角甾醇(5)、3β-羟基-(22E,24R)-麦角甾-5,8(9),22-烯-7-酮(6)、(24S)-麦角甾-7-烯-3β-醇(7)、22E,24R-麦角甾-7,22-二烯-3β-醇(8)和麦角甾醇(9);其余化合物分别为:腺嘌呤核苷(10)、5’-deoxy-5’-methylamino-adenosine (11)、5’-deoxy-5’-methylamino-9-(α-L-lyxofuranosyl)adenine (12)、(R)-4-methylpiperidin-2-one (13)、尿嘧啶核苷(14)、尿嘧啶(15)、烟酰胺(16)和1(2)-linolyl-2(1)-palmityl-glycero-O-4’-(N,N,N-trimethyl) homoserine (17)。其中化合物1-3的核磁信号全归属为首次报道,化合物13为新天然产物,化合物1-17均为该种首次分离。利用MTT法测定化合物对肿瘤细胞的细胞毒活性,结果显示甾体类化合物1、3-6和9对人乳腺癌细胞(MCF-7)、小鼠小胶质细胞(BV2)和人肺癌细胞(A549)均有较强的细胞毒活性。化合物10对BV2细胞呈现出中等强度的细胞毒活性,其IC50值为48.34 μmol/L。本研究对亚洲兰茂牛肝菌的化学成分进行了较为系统的研究,对亚洲兰茂牛肝菌的进一步开发利用具有重要意义。
为阐释抗炎活性与灵芝葡寡糖聚合度之间的关系,将灵芝β-葡寡糖组分GLPW-A (DP2-14)通过Bio-Gel P-2凝胶色谱柱分离,分别从洗脱液、流速以及每管接样量3个方面优化分离条件。通过阴离子色谱和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析测定其聚合度,并进行体外抗炎活性评价。当洗脱液为0.1 mol/L的NH4HCO3溶液,流速为0.1 mL/min,接样量为2 mL时分离效果最佳,根据出峰时间先后收集得到了8个组分(F1-F8)。聚合度分析表明,F8和F7分别为DP2和DP3的葡寡糖组分,其余6个组分F6-F1均为主要含有2-3种聚合度的葡寡糖。体外抗炎活性表明,主要含有DP4-DP6的F5和F6组分在浓度为0.5-10 μg/mL的范围内无明显抗炎活性,而其余各组分均在一定浓度下表现出不同程度的抗炎作用,且活性优于GLPW-A组分,说明灵芝β-葡寡糖的抗炎活性与寡糖片段的聚合度有关。
近年来,灵芝产业高速发展,但其主要药效成分灵芝三萜的含量较低,是影响其品质的重要原因,因此探索一种提高灵芝三萜含量的生物技术手段极具应用前景。本研究以6株斜盖伞Clitopilus spp.真菌为材料分别制备多种类型的真菌诱导子,将其添加到灵芝菌丝体液体摇瓶中,研究对灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜积累的影响。其中,Clitopilus sp. HSL-YX-7-A的高压灭菌发酵液(HSL FB)、C. hobsonii NL-19的菌丝干粉(NL-19 DMP)、C. prunulus 84496的发酵液提取物(84496 FBE)和Clitopilus sp. HSL-YX-7-A的菌丝提取物(HSL ME)显著提高了灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜含量,相对于对照组,生物量分别提高了450.09%、64.64%、46.97%和66.14%,灵芝三萜分别提高了53.01%、25.58%、25.17%和20.47%,灵芝三萜总产量则分别提高了585.15%、104.65%、86.43%和110.45%。进一步研究表明,经HSL FB、NL-19 DMP和HSL ME处理后,灵芝三萜生物合成途径关键酶基因hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs和osc的表达量显著上调;但84496 FBE处理之后仅上调了hmgs和sqs的表达量。且6个基因的平均表达量与灵芝三萜总产量的提升率呈显著的正相关性(R2=0.972, P<0.05)。本研究证实了斜盖伞诱导子能够有效提升灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜含量,其中C. hobsonii NL-19和Clitopilus sp. HSL-YX-7-A均为栎类树种的根系共生菌。本研究进一步为开发斜盖伞真菌作为微生物菌剂提供了基础,同时为提高栎树人工林的生产力和创建“以菌养菌”的药用真菌品质提升技术体系提供了重要策略。
通过代谢通量方法在3 L搅拌式发酵罐上研究了油酸对灵芝液态深层发酵代谢终产物羊毛甾醇代谢流分布的影响。结果表明,在灵芝的液态深层发酵过程中,添加油酸使合成羊毛甾醇的代谢通量提高45.29%;副产物麦角甾醇的含量由3.84 mg/g降低至0.02 mg/g;羊毛甾醇合成途径(LP)、三羧酸循环(TCA)、磷酸戊糖途径(PP)和糖酵解途径(EMP)的代谢通量比对照组分别提高了29.09%、14.52%、12.22%和2.11%。因此,添加油酸能够加强灵芝液态深层发酵过程中的整体代谢流分布,减少副产物麦角甾醇的积累,提高羊毛甾醇的代谢流量。该研究为下一步灵芝液态深层发酵中灵芝三萜得率的提高奠定研究基础。
本研究对盐地碱蓬内生菌Neocamarosporium sp. ZLM-26的活性次级代谢产物进行了挖掘。采用薄层色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱等分离方法,从该菌株大米培养基发酵产物的乙酸乙酯萃取物中分离得到6个单体化合物,经波谱学解析和文献数据对比,鉴定6个化合物分别为:5-butyl-6-(hydroxymethyl)-2H-pyran-2-one (1)、(7S)-xylariolide E (2)、(6S)-xylariolide D (3)、diaporpyrone A (4)、4-hydroxybenzaldehyde (5)和2-(2-hydroxyethyl) phenol (6)。分别采用CCK-8法和96孔板法评估了6个化合物的抗肿瘤和抗菌活性。结果显示,6个化合物(50 μmol/L)对胰腺癌细胞株SW1990、PANC-1的增殖无明显抑制作用;而化合物4对大肠杆菌有较好的增殖抑制活性,化合物5、6对铜绿假单胞菌有较好的增殖抑制活性。化合物1为1个新的天然产物,本研究首次报道了其核磁数据和抗菌活性。此外,化合物1-4均为首次从新凸轮孢菌属真菌中分离得到。
为阐明不同壳斗科树种木材栽培香菇产量及其主要营养成分差异,以江西大岗山地区9种主要壳斗科树种为材料,对其干部木材基本密度、含水率、全氮、全磷、全钾、有机碳、总酚含量及其培育香菇产量、蛋白质、多糖和脂肪质量分数进行了测定分析。不同壳斗科树种木材基本密度、木材含水率、全氮、全钾、有机碳、C/N、总酚质量分数、香菇总产量和蛋白质质量分数均存在显著或极显著差异,其中木姜叶柯培育香菇总产量最高,为170.58 g/kg,苦槠培育香菇蛋白质含量最丰富,达2.65 mg/g。壳斗科树种香菇日均产量趋势随时间推移呈现明显的波动性,细叶青冈和木姜叶柯在其第3次产香菇峰期时产量最高,而其他树种在第1潮菇时产量最高。香菇总产量与木材含水率和总酚质量分数呈极显著正相关关系,木材基本密度与香菇蛋白质质量分数呈显著负相关关系;香菇蛋白质质量分数与总产量显著负相关,多糖质量分数与脂肪质量分数极显著正相关。钩锥和白栎木材适宜作为香菇丰产栽培基质,在香菇生产中应用。
以羊肚菌培养基质为试验对象,采用常压低温等离子体技术对其进行杀菌处理,分别研究了等离子体处理过程中电压、频率、时间和次数4种单因素变量对菌落数和水分的影响,并通过正交实验优化了处理工艺条件。结果表明,细菌和真菌的杀菌率随常压等离子体处理电压、处理时间和处理次数的增大而增加,水分损失也随之增加,而随着频率的增大,杀菌率呈现先增大后减小的“火山型”趋势。不同处理条件下的杀菌效果普遍存在显著性差异(P<0.05)。正交实验表明4种影响因素大小为:频率>电压>时间>次数,最佳杀菌工艺条件为:电压30 kV,频率9.6 kHz,时间45 min,次数1次,此条件下细菌和真菌杀菌率分别为96.87%和93.77%,且水分损失较少。
菌株2-1-1于贵州大学校园樱花树干子实体中分离,通过形态学结构、ITS序列及系统发育树分析,鉴定其为白囊耙齿菌Irpex lacteus,对菌株2-1-1产生的3种木质素降解酶进行测定,发现菌株可分泌漆酶(laccase, Lac)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase, MnP)。利用菌株2-1-1对固体培养基条件下7种染料的脱色能力进行检测,筛选出较易脱色的刚果红染料,同时采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectroscopy, GC-MS)分析确定经白囊耙齿菌降解的刚果红染料代谢产物,并对其进行脱色条件优化和毒力测验,试验分析表明:菌株2-1-1对7种染料均有脱色,对刚果红脱色效果较佳。GC-MS分析刚果红染料降解产物主要为联苯胺、联苯、苯乙烯、十六烷和3-硝基苯酚。单因素和综合优化脱色条件:染料浓度50 mg/L,碳源为果糖、金属离子为锌离子、pH 7,该条件下刚果红染料脱色效果最优。优化条件下菌株2-1-1对刚果红染料脱色率达91.03%,相比对照组脱色率提高17.13%,刚果红染料经菌株2-1-1脱色前后毒力测试:染料原液>脱色后>清水处理,表明该菌株可降低刚果红染料毒性。