李文佳
, 韦瑞升
LI Wen-Jia, WEI Rui-Sheng
通讯作者:
收稿日期: 2015-12-14
接受日期: 2016-03-7
网络出版日期: 2016-04-20
版权声明: 2016 中国科学院微生物研究所《菌物学报》编辑部 版权所有
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摘要
西藏林芝地区冬虫夏草天然产区野生虫草蝙蝠蛾幼虫的肠道液pH范围为9.69-10.99,体外在此pH下培养冬虫夏草菌长势较差。同时,在该pH的体外模拟中肠液中,虫菌体也会在极短的时间内消亡,而对自然侵染的蝙蝠蛾幼虫的血淋巴、消化道及其“反吐物”（肠液）进行切片和显微镜检却发现,蝙蝠蛾幼虫消化道、呕吐物中均存在与血淋巴中相同的冬虫夏草菌菌体形态,生存状态良好,正常增殖,表明蝙蝠蛾幼虫肠道的生理状态可以维系并支撑冬虫夏草菌菌体某种形态的存在与生长,并证实冬虫夏草菌由口器及消化道入侵蝙蝠蛾幼虫的可能性;肠道虫菌体与血淋巴虫菌体不一定同时存在,表明冬虫夏草菌对蝙蝠蛾幼虫的侵染可能同时存在表皮侵染和肠道侵染两种途径。本文为冬虫夏草菌对蝙蝠蛾幼虫的侵染途径研究提供更加多样化的信息支持。
关键词：
Abstract
The intestinal juice pH of wild Hepialus larvae in cordyceps natural production areas in Nyingchi of Tibet was between 9.69 and 10.99. Under this pH, Ophiocordyceps sinensis grew in undesirable way in vitro. In mimic intestinal juice under this pH, the thalli died out within a very short time. However, microscopic examination of paraffin section of hemolymph, digestive tract and “vomit” (intestinal juice) of naturally infected Hepialus larvae showed that the same cordyceps fungus was found to be existed in digestive tract and “vomit” as in hemolymph, and the fungus was in good condition and propagated normally, indicating that the physiological state of Hepialus larval gut could maintain and support the fungus existing and growing in a certain form, and confirming the possibility that the Hepialus larvae could be infected by O. sinensis via mouth and digestive tract. The intestinal thalli and hemolymph thalli might not exist at the same time. It is suggested that the larvae may be infected by the way of skin infection and intestinal infection.
Keywords：
冬虫夏草Chinese cordyceps,Ophiocordyceps sinensis (Berk.) G.H. Sung et al.是我国传统的名贵中药材,是由冬虫夏草菌侵染青藏高原高山草甸土中的蝙蝠蛾幼虫而形成的菌核与真菌子座的复合体（戴玉成和李玉2011;张姝等 2013）。Sung et al.（2007）基于多基因系统学分析的结果对广义虫草属Cordyceps s.l.进行分类,将冬虫夏草归为线虫草科Ophiocordycepitaceae G.H. Sung et al.的线虫草属Ophiocordyceps Petch.。
2015年版《中华人民共和国药典》记载冬虫夏草“甘,平。归肺、肾经。补肾益肺,止血化痰。用于肾虚精亏,阳痿遗精,腰膝酸痛,久咳虚喘,劳嗽咯血”（国家药典委员会2015）。由于其具有独特的药用价值,加上野生资源不断减少、市场价格飙升,冬虫夏草受到国内外各界人士的关注,也成为近年科学研究的热点（Zhang et al. 2012）。冬虫夏草菌与宿主昆虫之间复杂的侵染关系吸引了大量研究者,杨大荣等（1988）指出冬虫夏草菌主要以子囊孢子粘附幼虫新嫩表皮,进入体腔形成菌丝体。涂永勤等（2010）研究则认为,冬虫夏草菌侵入寄主幼虫体内的途径主要是通过口器取食。冬虫夏草菌侵入蝙蝠蛾幼虫的侵染途径至今尚无精确定论。
本文将通过模拟蝙蝠蛾幼虫肠道环境,结合组织切片技术,通过荧光增白剂荧光染色显微观察研究冬虫夏草菌在其中的生长状态,并与自然侵染的蝙蝠蛾幼虫的血淋巴、消化道及其“反吐物”中冬虫夏草菌的生存状态进行对比分析,期望为阐明冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫的途径提供实验证据。
供试幼虫为西藏林芝地区冬虫夏草天然产区野生虫草蝙蝠蛾幼虫。选取发育度相对一致的幼虫于洁净区中饲养,用于实验观察。
从西藏、青海等地采集冬虫夏草样品,从中分离得到冬虫夏草菌株,经形态学及分子系统学鉴定为冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis。实验选取编号为ZZC-035、ZZC-121、CZC-056,本实验标记为1#、2#、3#菌用于摇瓶发酵。
选取野生2-6龄健康幼虫各50条,实验前饥饿处理72h,排空体内食物残渣。用手轻微按压蝙蝠蛾幼虫头胸部,使之吐出肠液,滴于精密试纸上,依据试纸的颜色对照标准色读出其肠液pH值,并记录数值。
本次实验选用加富PDA液体培养基（去皮马铃薯200g煮沸30min后过滤取滤液,葡萄糖20g、酵母粉10g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、无水硫酸镁0.25g,加水定容至1 000mL,自然pH）进行冬虫夏草菌的摇瓶培养,培养基模拟蝙蝠蛾幼虫肠道调节pH至9.5-11.0。调节用缓冲剂为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
供试1#、2#、3#菌经由加富PDA液体培养基摇瓶发酵14d至对数期后,过滤清洗获得菌渣。再将等重的3种菌渣分别加入到无菌水中,用匀浆捣碎机捣碎使之分散均匀。
将配制好的菌悬液按每瓶10mL加入到90mL配置好的培养基中,18℃下200r/min摇瓶培养至15-25d,测得对照组菌丝体生长开始下降时,测定实验组其菌丝体干重。
用0.1-0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9.5-11）配制不同pH的复合酶模拟消化液,胰蛋白酶、纤维素酶按1:1同时溶于上述各种缓冲液中,使2种酶的终浓度分别为0.5%。酶液过滤除菌后于4℃保存备用。以同样方法配制蛋白酶K、纤维素酶复合酶模拟消化液（僧明华等 2009）。
由野生被侵染幼虫获得大量血淋巴液,无菌水清洗抽滤获得大量冬虫夏草菌虫菌体（李泉森等 1998）,再将其配置成107/mL的菌悬液,并分装于离心管中,每支离心管分装3mL,并加入500μL模拟消化液,轻微震荡使其悬浮。所有处理组分别在18℃恒温培养7d,每日每组取样镜检观察虫菌体状态。
1.6.1 蝙蝠蛾幼虫淋巴液及消化液涂片观察：定期自感菌幼虫群体内抽取100条幼虫进行调查。轻轻挤压蝙蝠蛾幼虫头胸部,使之吐出肠液,再轻微按压幼虫尾部,使排出少量液体,分别取样镜检观察。同一幼虫再用取样针提取少量血淋巴液镜检观察。记录各样液中虫菌体数量、生长发育状态,并拍照。同批追踪观察直至6龄,先后共观察1 000头以上幼虫。
1.6.2 蝙蝠蛾幼虫组织切片观察：采用常规组织切片制作方法,固定液配方按照乙醇:冰醋酸:三氯甲烷9:3:1进行配置。幼龄虫固定24h后脱水、透明、浸蜡包埋、进行切片,然后进行HE染色（苏木精-伊红染色）、Calcofluor White Stain荧光增白剂荧光染色观察,荧光显微镜型号为徕卡DM3000。
统计数据显示,林芝地区不同龄期的蝙蝠蛾幼虫其肠液pH在10左右,集中在9.69-10.99范围内（表1）。
表1 林芝地区不同龄期蝙蝠蛾幼虫肠液pH值
Table 1 pH values of intestinal juice at different ages of Hepialus larva from Nyingchi area
| 虫龄 Instar | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|
| pH值 pH value | 10.22± 0.53 | 10.31± 0.32 | 10.48± 0.36 | 10.34± 0.24 | 10.59± 0.4 |
通过体外模拟蝙蝠蛾幼虫肠道pH,研究了冬虫夏草菌的生长情况。供试的3株菌在pH 6.5时均生长正常,而在pH 9.5-11时,生长显著下降或不生长（表2）。
表2 模拟肠道pH条件下冬虫夏草菌菌丝体干重
Table 2 The dry weight of the mycelia of Ophiocordyceps sinensis under the condition of simulated pH in intestinal tract of Hepialus larva
| pH值 pH value | 1#菌丝体干重 Dry weight of 1# (g/100mL) | 2#菌丝体干重 Dry weight of 2# (g/100mL) | 3#菌丝体干重 Dry weight of 3# (g/100mL) |
|---|---|---|---|
| 6.5 | 1.3842±0.0462 | 1.2486±0.0342 | 1.3654±0.0383 |
| 9.5 | 0.2215±0.0186 | 0.2463±0.0191 | 0.2676±0.0185 |
| 10.0 | 0.1144±0.0041 | 0.1045±0.0061 | 0.1378±0.0037 |
| 10.5 | 0.0646±0.0025 | 0.0698±0.0020 | 0.6760±0.0031 |
| 11.0 | 0.0545±0.0023 | 0.0343±0.0050 | 0.0445±0.0032 |
幼虫血淋巴液即时取出观察虫菌体,虫菌为两头尖梭形,细胞结构明显（图1A）。体外模拟中肠液实验处理48h后,虫菌体状态开始改变,虽其外形未发生明显改变,但整体外形相对缩小,且内部结构模糊,即认为虫菌体已开始瓦解。处理时间延长虫菌体状态不发生明显改变（图1B）。不同酶液处理环境条件下的虫菌体变化几无差异,因此不额外附加图片说明。
图1 体外模拟中肠液虫菌体状态
A：幼虫血淋巴液即时取出观察虫菌体,呈两头尖中间粗的标准梭形;B：蛋白酶K、纤维素复合酶实验处理48h、72h、96h后虫菌体状态,整体外形相对缩小,内部结构模糊.
Fig. 1 Thalli in simulated intestinal juice in vitro.
A: Thalli in normal form, slightly thick at middle, slightly acute at both ends; B: Condition of thalli under treatment of proteinase K, cellulose complex enzyme for 48h, 72h and 96h. The worm body shrank and the internal structure was fuzzy.
经涂片观察,幼虫血淋巴内存在大量虫菌体（图2）,呕吐物及肛门分泌物中也同时存在大量虫菌体,且在形态上无差异,数量上呕吐物中的虫菌体数量较少。取样过程中发现,血淋巴中含有虫菌体的幼虫,其肠道内不一定有虫菌体。同时在肠道中发现虫菌体的幼虫,其血淋巴中也不一定有虫菌体。即肠道虫菌体与血淋巴虫菌体不一定同时存在。
经切片观察,幼虫消化道内确实存在与血淋巴相同的虫菌体,纵切面显示肠道内的虫菌体能够正常生长,其表现为出芽生殖（图3）。
图2 蝙蝠蛾幼虫淋巴液及消化液涂片
A：正常血淋巴及虫菌体,圆形为血淋巴细胞;B：幼虫排泄物中存在虫菌体,阴影部分为排泄物残渣;C：呕吐物中的虫菌体,正在进行出芽生殖,因呕吐物颜色为黄绿色,因此照片颜色较深.
Fig. 2 Observation of Hepialus larva blood lymph and secretion.
A: Normal Hepialus larva blood lymph and cordyceps thalli, the round ones are blood lymph; B: Thalli in larva secretion, the shadow part is the waste residue; C: Thalli in vomit.
图3 蝙蝠蛾幼虫组织切片染色观察
A-C：肠道内的虫菌体,图片中集中区域为中肠附近（箭头所示）;D-E：肠道内部正常生长的虫菌体,正在出芽生殖;F：肠道周围血淋巴中正常的虫菌体;G：荧光染色观察到的肠内虫菌体（箭头所示）.
Fig. 3 Staining observation of Hepialus larva tissue slice.
A-C: Thalli in intestinal tract of cordyceps larva, the concentrated area of thalli in midgut of cordyceps larva (arrow); D-E: Thalli with normal growth, some are budding; F: Thalli in blood lymph around the intestinal tract; G: Thalli found in intestinal tract after fluorescent staining (arrow)．
本实验采用体液涂片配合组织切片及荧光染色的方法,证明了冬虫夏草菌在寄生阶段确实能够在肠道内存在与血淋巴中相同形态的冬虫夏草菌菌体,生存状态良好,正常增殖。同时,在体外的情况下,冬虫夏草菌的菌丝体并不能在肠道pH下生长,推测该pH下,冬虫夏草菌必须转化成其他形态,如虫菌体,方可继续存活。而寄生阶段的虫菌体,在模拟蝙蝠蛾幼虫肠道pH的发酵液环境或人工肠道模拟环境下也不能维持正常的形态。故认为冬虫夏草菌菌体在蝙蝠蛾幼虫肠道内必须完成形态转化,并依靠活体幼虫内的营养物质,才能在其肠道内固有的生理状态下正常生存繁殖。
据此推断,虫菌体在肠道内的生长繁殖依赖且仅依赖活虫肠道内营养供给,并在此条件下进行正常的生殖发育。长久以来,冬虫夏草菌究竟是以何种途径入侵寄主昆虫体内一直困扰着众多的科研工作者。本文的研究证实冬虫夏草菌由口器及消化道入侵蝙蝠蛾幼虫的可能性。同时鉴于幼虫肠道虫菌体与血淋巴虫菌体不存在同步性,即冬虫夏草菌对蝙蝠蛾幼虫的侵染可能同时存在表皮侵染和肠道侵染两种途径。
目前野生冬虫夏草资源日益匮乏,冬虫夏草的人工繁育成为近年来科学研究的热点。提高冬虫夏草菌对蝙蝠蛾幼虫的侵染率和速度,是冬虫夏草繁育技术的关键所在。在存在口器侵染的可能下,通过某种方式,使得冬虫夏草菌能够快速、大量地进入幼虫体内,进而达到冬虫夏草对幼虫高效侵染的目的,对如何提高冬虫夏草成品的产量,降低冬虫夏草繁育的成本,具有重要意义。
The authors have declared that no competing interests exist.
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Notes on the nomenclature of six important medicinal fungi in China.
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A preliminary study on generations alternation of Cordyceps sinensis fungus.
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Experimental study of Hepialus larvae infected by Ophiocordyceps sinensis.
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Studies on Hepialus larvae infected by Codyceps sinensis.
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Ophiocordyceps sinensis and Cordyceps militaris: research advances, issues and perspectives.
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Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology. |
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中国六种重要药用真菌名称的说明 .
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冬虫夏草菌世代交替的初步研究 .
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蝠蛾属幼虫感染冬虫夏草菌的实验研究 .
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模拟昆虫中肠环境对球孢白僵菌分生孢子的影响 .
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冬虫夏草真菌感染蝠蛾幼虫的研究 .
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冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望 .
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