落叶松-杨栅锈菌Melampsora larici-populina Kleb.是一种活体营养专性寄生真菌,它必须从活体寄主细胞中获得所需营养物质才能正常生长和发育。由该锈菌引起的杨树叶锈病是一种严重危害杨树生产的世界性重大真菌病害,普遍发生于欧洲和北美地区,以及我国东北、华北、西北、西南等地,从而造成重大经济损失（张山林 1990;Steenackers et al. 1996;Pinon & Frey 2005）。防治该病害的主要措施是选用抗病品种,但是,由于落叶松-杨栅锈菌致病性变异、新生理小种的不断出现,往往导致品种的抗病性降低或丧失（田呈明 等 2000;曹支敏等 2005）。在组织学和细胞学水平上深入研究锈菌与寄主的互作关系,可为合理利用寄主抗病性奠定基础。栅锈菌的活体专性寄生特性、感病杂交杨的有效遗传转化体系的缺乏以及杨树相对长久的生长周期等,都制约了栅锈菌与杨树互作分子机制的研究（Hacquard et al. 2011）。杨树和落叶松-杨栅锈菌全基因组序列的公布,为寄主抗锈机制和病菌致病机理的研究提供了有利条件（Tuskan et al. 2006;Duplessis et al. 2011）。国外学者曾就落叶松-杨栅锈菌和杨树之间亲和互作的组织病理学进行过初步研究,并发现非亲和互作中杨树对该锈菌的抗性受到过敏性反应的调控（Laurans & Pilate 1999;Rinaldi et al. 2007）。国内学者曾针对不同抗性杨树品种与该锈菌不同菌系互作的组织病理学特征开展过研究（田呈明等 2001）。到目前为止,国内仍缺少对落叶松-杨栅锈菌侵染杨树叶片的组织学过程或亲和互作过程的研究。本文利用光学显微镜、电子显微镜和荧光染色技术,在组织学水平上对落叶松-杨栅锈菌在感病杨树叶片上的发育过程进行了系统观察,旨在为该锈菌致病分子机理的研究奠定理论基础,同时为杨树叶锈病的有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌种为落叶松-杨栅锈菌陕西渭河单孢菌系Wh03,由西北农林科技大学林学院森林病理学实验室提供。用繁殖寄主太白杨Populus purdomii在温室人工扩繁菌种,参照曹支敏等（1998）的方法进行菌种的活化及保存。

供试杨树为感病品种中林美荷（P. deltoids×P. nigra,欧美杨品种）,采自西北农林科技大学林学院苗圃（刘莉丽等 2008）。

1.2 接种培养

采集中林美荷杨1年生的插条,在西北农林科技大学植物保护学院温室进行盆栽。待生长8-9周后,选取生长状态基本一致的成熟健康叶片作为接种叶片,用浓度1-2mg/mL的Wh03菌系夏孢子悬浮液,按照曹支敏等（1998）的方法进行接种,同时以涂抹无菌水的健康叶片作为对照。将接种后的植株放置于保湿桶内保湿36h,然后置于温度18-24℃、相对湿度60%、16h光周期的温室培养,于不同培养时间进行取样。

1.3 荧光染色样品制备

接种6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h后分别取样,将样品切成约1cm×0.5cm的小片,置于含有1.5g/L三氯乙酸的V（乙醇）:V（氯仿）=3:1固定透明液中进行固定透明,更换透明液至不变色,然后将小片转入饱和水合氯醛（2.5g/mL）中至完全透明。参照康振生等（1993）的方法,将透明好的样品置于Calcofluor white染料（Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA）中避光染色5min,在OLYMPUS荧光显微镜（BX52+DP72）下观察、统计和拍照。为了获得高质量的锈菌侵染图片,参考Ayliffe et al.（2011）的方法,用偶联Alexa 488荧光素的小麦凝集素（Wheat germ agglutinin-Alexa 488,Invitrogen,USA）对样品进行染色之后,在OLYMPUS激光共聚焦显微镜（FV1000）下观察和拍照。

1.4 扫描电镜和透射电镜样品制备

接种6h、12h、24h后分别取样,参照姚娟妮等（2012）的方法,将样品切成约0.5cm×0.5cm的小片,在4%戊二醛磷酸缓冲液（pH6.8）中4℃下固定过夜,经不同浓度梯度乙醇脱水,醋酸异戊酯置换,CO₂临界点干燥以及真空镀膜后,在HITACHI S-4800型扫描电镜下观察和拍照。

接种72h、96h、120h和168h后分别取样,参照康振生（1996）的方法,在4%戊二醛磷酸缓冲液中（0.1mol/L,pH6.8）4℃下固定3-6h,在同样的磷酸缓冲液中冲洗3-5次,再用1%锇酸在4℃下固定2h。再次用相同浓度的磷酸缓冲液冲洗样品1.5-2h后,用不同浓度梯度的乙醇脱水,LR-white树脂渗透、包埋,60℃下至少聚合48h。样品半薄切片经甲苯胺蓝染色,光学显微镜下观察夏孢子堆的形态。样品超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后,于JEM-1230型透射电镜（JEOL Co. Ltd,Japan）下进行观察和拍照。

2 结果与分析

2.1 夏孢子接种杨树叶片的发病情况

用落叶松-杨栅锈菌夏孢子悬浮液接种杨树叶片,进而观察二者互作的宏观表现。接种5d后,杨树叶片表面出现明显的褪绿斑。接种6d后,在叶片背面褪绿斑处明显可见桔黄色夏孢子堆,叶片正面褪绿斑处也可见桔黄色夏孢子堆外露,但数量明显少于背面。接种8d后,叶片背面密生夏孢子堆（图1）。夏孢子堆周围无组织坏死现象,寄主杨树接种后表现为典型的“4”型反应,即高度感病反应。因此,中林美荷杨和落叶松-杨栅锈菌菌系Wh03间呈亲和性反应。

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图1   落叶松-杨栅锈菌和杨树亲和互作的宏观表现（接种5d、6d、8d后）

Fig. 1   Macroscopic observations of the compatible interaction between Melampsora larici-populina and poplar (5, 6 and 8d post-inoculation).

2.2 夏孢子的形态及其在杨树叶片上的萌发特征

扫描电镜观察表明,落叶松-杨栅锈菌夏孢子的形态主要为椭圆形和长椭圆形,表面生有近圆锥形的刺突（图2A,B）。而且,刺突表面不光滑（图2C）。

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图2   落叶松-杨栅锈菌夏孢子的形态
A和B：椭圆形和长椭圆形的夏孢子,表面生有近圆锥形的刺突（箭头处）,标尺=10μm;C：夏孢子刺突表面不光滑,标尺=1μm.

Fig. 2   Ultrastructure observation of urediniospore of Melampsora larici-populina.
A, B: The urediniospores oval or long-elliptic, echinulate on the surfaces (arrows), bars=10μm; C: The echinule surface on uredioniospore, bar=1μm.

在适宜的条件下,接种6h后,夏孢子萌发率为99.06%,几乎所有夏孢子都已在叶片表面萌发产生芽管（图3）。扫描电镜观察该阶段萌发的夏孢子,结果显示夏孢子表面形成的芽孔数目不等,包括1个、2个、3个和4个等4种类型（图4A,C,E,G）。其中,75%的夏孢子具有2个或3个芽孔。每个芽孔萌发生一根芽管。当夏孢子表面仅有1个芽孔时,其产生的一根芽管会继续发育,加长变粗,并在伸长时形成丰富的分枝（图4B）。当多于1个芽孔时,在大多数情况下,其中一根芽管继续发育,加长变粗,在伸长时形成丰富的分枝,而其余芽孔萌发的芽管只生长一定距离后不再生长（图4D,F,H）。在接种12h和24h后,夏孢子的萌发率分别为98.47%和99.3%,与接种6h后没有显著差异（图3）。

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图3   落叶松-杨栅锈菌夏孢子在杨树叶片上的萌发率（接种6、12、24h后）

Fig. 3   Germination rate of Melampsora larici-populina urediniospores on poplar leaves (at 6, 12 and 24 hpi). The value referring to the mean ± standard deviation of three independent replicates. Data from three independent replicates being analyzed with Duncan’s multiple range test. The same letter indicating no significant difference (P=0.05).

2.3 夏孢子在叶片上的侵入情况

观察发现,夏孢子可利用两种方式侵入叶表气孔结构,在气孔下室中形成气孔下囊,进而产生侵染菌丝。一种方式为夏孢子萌发的芽管从气孔直接侵入（图5A）,另一种方式为芽管顶端膨大形成附着胞结构后从气孔侵入（图5B,C）。未观察到芽管从叶片表面直接侵入的现象。接种6h后,41.56%已萌发的夏孢子产生气孔下囊（图6）。气孔下囊的形状多样,包括椭圆形、长椭圆形、梨形、圆形、不规则形等,其中以椭圆形居多。随着侵染时间的增加,至接种12h后,该比例增至68.2%,表明超过2/3已萌发的夏孢子产生了气孔下囊,至接种24h后,气孔下囊形成比例（76.54%）与接种12h后没有显著差异（图6）。

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图4   落叶松-杨栅锈菌夏孢子在杨树叶片上的萌发特征（接种后6h） A,B：具有一个芽孔的夏孢子的萌发特征;C,D：具有2个芽孔的夏孢子的萌发特征;E,F：具有3个芽孔的夏孢子的萌发特征;G,H：具有4个芽孔的夏孢子的萌发特征. 箭头所示为芽孔处. 标尺=10μm.

Fig. 4   Germination features of Melampsora larici-populina urediniospores on poplar leaves (6h post-inoculation). A, B: The urediniospore with one germ pore; C, D: The urediniospores with two germ pores; E, F: The urediniospore with three germ pores; G, H: The urediniospore with four germ pores. The germ pores being shown by arrows. Bars=10μm.

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图5   落叶松-杨栅锈菌夏孢子穿透杨树叶表气孔结构的方式（接种后6h） A：芽管从气孔直接侵入;B和C：芽管顶端膨大形成附着胞结构后从气孔侵入. 标尺=10μm. SP：夏孢子;GT：萌发的芽管;A：附着胞;S：气孔.

Fig. 5   Penetration types of poplar stomata by Melampsora larici-populina urediniospores (SEM) (6h post-inoculation). A: Direct penetration of stoma by germ tubes; B, C: Penetration of stoma via appressorium. Bars=10μm. SP: Urediniospore; GT: Germ tube; A: Appressorium; S: Stoma.

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图6   落叶松-杨栅锈菌夏孢子在杨树叶片上的气孔下囊产生率（接种6、12和24h后）

Fig. 6   Formation rate of substomatal vesicles of Melampsora larici-populina urediniospores on poplar leaves (at 6, 12 and 24 hpi). The value referring to the mean ± standard deviation of three independent replicates. Data from three independent replicates being analyzed with Duncan’s multiple range test. The same letter indicating no significant difference. Different letters showing statistically significant difference (P=0.05).

2.4 病菌在寄主体内的扩展和定殖情况

利用偶联Alexa 488荧光素的小麦凝集素进行荧光染色来观察落叶松-杨栅锈菌在杨树叶片组织内部的扩展和定殖情况。接种6h后,大部分气孔下囊形成一根初生侵染菌丝（图7A）;接种12h后,未观察到吸器的产生;接种24h后,1/3的侵染点（侵染点的建立以形成气孔下囊为标志）可观察到吸器的形成（图7B）;接种48h后,侵染菌丝在叶肉细胞间隙不断蔓延分枝,吸器数量也明显增加,从而汲取更多养分来满足病菌生长发育的需要。接种3d后,几乎每个侵染点已形成一个菌落结构（图7C）;接种4d后,菌落组织相互交织在一起（图7D）;至接种5d后,大量产孢菌丝聚集在一起形成垫状的夏孢子床。然后,产孢细胞不断分化形成夏孢子,聚集而成的夏孢子堆和侧丝藏于寄主表皮之下,同时植物叶肉细胞间隙被大量侵染菌丝所定殖（图7E）。

通过透射电镜进一步观察落叶松-杨栅锈菌的侵染结构发现,胞间菌丝具有隔膜,幼嫩菌丝的原生质体较稠密,而老龄菌丝原生质体稠密度减弱,并且含有大量液泡（图8A-C）。胞间侵染菌丝接触到叶肉细胞,顶端产生隔膜后分化出吸器母细胞,吸器母细胞形成入侵栓后穿破植物细胞壁进而形成吸器。吸器母细胞通过吸器颈将原生质体运输到吸器中,当吸器成熟后吸器母细胞则变得中空（图8D）。常规固定染色后呈波浪状的吸器外质膜与吸器体壁之间保持一定的距离,从而形成吸器外间质,因此,吸器并未与寄主细胞的原生质接触（图8E）。与其他多数锈菌比较相似,该锈菌吸器中的细胞核基本为双核,未发现类似小麦条锈菌吸器的多核现象,并且还观察到两个吸器共存于一个叶肉细胞中的现象（图8E）。

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图7   落叶松-杨栅锈菌在感病杨树叶片内侵染结构的发育过程
A：初生侵染菌丝（接种6h后）;B：吸器（接种24h后）;C：菌落结构（接种3d后）;D：菌落组织（接种4d后）;E：夏孢子堆和侧丝. A-D：标尺=20μm;E：标尺=50μm. SSV：气孔下囊;PIH：初生侵染菌丝;S：气孔;IH：侵染菌丝;HMC：吸器母细胞;H：吸器;SP：夏孢子;PA：侧丝;E’：植物表皮.

Fig. 7   The developing process of infection structures of Melampsora larici-populina in leaves of susceptible poplar cultivar.
A: A primary infection hypha (6h post-inoculation); B: Haustoria (24 hpi); C: Colony structures (72 hpi); D: Fungal colonies (96 hpi); E: Uredinium and paraphyses. A-D: Bars=20μm; E: Bar=50μm. SSV: Substomatal vesicle; PIH: Primary infection hyphae; S: Stoma; IH: Infection hyphae; HMC: Haustorial mother cell; H: Haustorium; SP: Urediniospore; PA: Paraphysis; E’: Epidermis.

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图8   落叶松-杨栅锈菌侵染结构的超微结构观察
A：具隔膜胞间菌丝;B：幼嫩菌丝原生质体;C：老龄菌丝原生质体;D：吸器母细胞、入侵栓及吸器;E：吸器内双细胞核. 标尺=1μm. S：隔膜;IH：侵染菌丝;HC：寄主细胞;HMC：吸器母细胞;P：侵入钉;HN：吸器颈;H：吸器;N：细胞核;EHM：吸器外质膜.

Fig. 8   Ultrastructural observation of infection structures of Melampsora larici-populina.
A: Intercellular hyphae with septa; B: Young intercellular infection hyphae; C: Old hyphae; D: Haustorial mother cell, penetration peg and haustorium; E: Two nuclei in haustorium. Bars=1μm. S: Septum; IH: Infection hyphae; HC: Host cell; HMC: Haustorial mother cell; P: Penetration peg; HN: Haustorial neck; H: Haustorium; N: Nucleus; EHM: Extrahaustorial membrane.

3 讨论

本文通过光镜和电镜技术,在组织学水平上对落叶松-杨栅锈菌在感病杨树叶片上的侵染过程进行了系统研究。结果表明,接种6h后,几乎所有夏孢子（99.06%）在杨树叶片表面萌发形成芽管,表明夏孢子萌发的高峰期处于接种6h或之前阶段。田呈明等（2001）研究发现接种24h后不同抗病性品种上的落叶松-杨栅锈菌夏孢子均开始萌发,其中,表现为“4”型反应的寄主叶片上夏孢子的萌发率不到20%,至接种48h后,不同抗性品种上的夏孢子萌发率均在92.11%以上。研究表明杨树品种影响落叶松-杨栅锈菌的侵染过程,包括夏孢子萌发的效率和进程、芽管扩展进程和方式、以及气孔是否能够被穿透等（Chiba 1964; Mlodzianowski et al. 1978）。因此,推测这些差异与寄主品种、接种时环境条件、植物叶片幼嫩程度、夏孢子新鲜程度及营养状况等有关。当夏孢子表面具有多个芽孔时,在大多数情况下,仅其中一根芽管会加长变粗并形成丰富的分枝,而其余芽孔萌发的芽管生长距离有限,这与田呈明等（2002）的观察结果相类似,表明该锈菌依据此萌发和生长方式是为自身生长发育及侵入到叶片组织内部提供足够的能量。

落叶松-杨栅锈菌和北美栅锈菌夏孢子萌发的芽管虽然能够直接穿透寄主植物表皮细胞,但这种情况较少发生,病菌主要通过叶表气孔侵入,然后进入寄主组织内部（Spiers & Hopcroft 1988）。如果病菌直接穿透表皮细胞后可能会立即引起寄主细胞坏死,同时也不能产生侵染结构,从而导致侵入失败（Spiers & Hopcroft 1988）。如同田呈明等（2001）的观察结果一样,作者未发现落叶松-杨栅锈菌夏孢子通过芽管直接侵入叶片表面的现象。该锈菌夏孢子可通过芽管或者附着胞结构侵入叶表气孔从而进入寄主组织内部。Wemer（1982）认为落叶松-杨栅锈菌根据气孔表面特殊的纹饰和保卫细胞的结构来识别气孔。叶表气孔结构属于自然孔口,较植物叶表细胞而言,或许更便于病菌侵入。有些学者未观察到落叶松-杨栅锈菌形成附着胞的现象（Chiba 1964;Taris 1968;Wemer 1982;Spiers & Hopcroft 1988）。然而,Rinaldi et al.（2007）研究发现,附着胞不是落叶松-杨栅锈菌夏孢子穿透气孔所必需的,芽管或菌丝也可直接穿透气孔。稻瘟病菌分生孢子在叶片表面萌发产生芽管后会在顶端分化出附着胞,随后依其内部产生巨大的膨压而使侵入钉穿透叶片表皮产生侵入菌丝（Howard et al. 1991;Talbot et al. 1996）。人造膜条件下诱导产生附着胞实验表明,至少8种锈菌受向触性刺激可产生附着胞（Littlefield & Heath 1979）。

吸器是锈菌、白粉菌、霜霉菌等专性寄生菌形成的一种代表性的侵染结构,它不仅能够帮助病原菌从寄主细胞中吸收营养,还可能在抑制寄主防卫反应或重新调控寄主新陈代谢等方面具有一定的作用（Voegele & Mendgen 2011）。本研究发现,接种12h后落叶松-杨栅锈菌无吸器形成,但接种24h后在一些侵染点处可观察到吸器的存在,说明该锈菌第一个吸器结构形成于接种12h后和24h前。这与Laurans & Pilate（1999）发现接种17h后落叶松-杨栅锈菌在感病杨树叶肉细胞内部形成第一个吸器结构的结论较一致。然而,田呈明等（2001）报道,在同样表现为“4”型反应的杨树叶片上,该锈菌在接种12h后便形成吸器。吸器出现的时间及数量与寄主-锈菌组合的抗病性密切相关,寄主表现相同反应型的感病组合中第一个吸器出现的时间略有差异,这有待于进一步研究。

本文对落叶松-杨栅锈菌在感病杨树寄主上的发育过程进行了系统的组织学研究,由此将其侵染过程大致分为3个阶段。第一个阶段为侵染早期阶段（0-12 hpi）,锈菌夏孢子在叶片表面萌发出芽管,直接或形成附着胞结构侵入叶表气孔结构,随后在气孔下室中形成气孔下囊,进而产生胞间侵染菌丝,该阶段吸器尚未形成。第二个阶段为活体营养寄生阶段（24-96 hpi）,吸器数量显著增加,菌丝在叶肉细胞间隙不断扩展分枝生长,最终形成菌落结构。第三个阶段为产孢阶段（120 hpi以后）,产孢菌丝多次分化形成夏孢子,聚集在表皮之下形成夏孢子堆,最终夏孢子成熟后顶破表皮外露,完成侵染过程。

The authors have declared that no competing interests exist.

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