活体实验模型是体内试验的金标准,然而,伦理和成本问题、专门的培训要求促使科学家们为此类模型开发新的替代方案（Jorjao et al. 2018）。近几十年来,微生物学家为研究微生物毒力、致病机制及抗菌药物的功效,不断寻找哺乳动物的替代品,其中,昆虫感染模型成为了有前景的替代动物。与其他非脊椎动物模型宿主,如线虫相比,昆虫具有相对高级的抗菌防御系统。由于免疫系统的差异,昆虫模型与哺乳动物模型的研究结果有一定的差异（Bogus et al. 2007;Frenkel et al. 2016）。多项研究表明,大蜡螟幼虫作为一种昆虫模型,大部分研究结果与哺乳动物模型有正相关性（Brennan et al. 2002;Brunke et al. 2015;Desalermos et al. 2015;Fuchs et al. 2016;Sangalli-Leite et al. 2016）。因此,目前大蜡螟已被科学界广泛接受为微生物感染的实验模型,是较理想的感染模型。生物基因组的研究表明,包括昆虫在内的无脊椎动物中,有许多与人类基因同源物编码产物参与病原体的识别或信号转导。因此,昆虫如果蝇、德国小蠊、库蚊、家蚕和大蜡螟可用于研究微生物毒力、宿主免疫力或评估体内抗生素的功效（Mikulak et al. 2018）。大蜡螟幼虫最初应用于研究酵母菌中人类易感真菌病原体模型（Cotter et al. 2000）,随后逐渐被用于其他真菌病原体包括白念珠菌、隐球菌、曲霉菌、镰刀菌以及罕见的真菌菌种的研究。
1 大蜡螟的生物学特征
1.1 大蜡螟的特点
大蜡螟属于鳞翅目、螟蛾科、蜡螟亚科,广泛分布于世界各地,其幼虫吞食蜂巢,是养蜂业的重要害虫。同时,由于大蜡螟繁殖力强,生长周期短,无自残性,可以在室内高密度饲养,是线虫、细菌、真菌、病毒和分子生物学等研究领域的重要实验昆虫模型（NanGong et al. 2015）。大蜡螟幼虫相比于其他的体内模型具有以下多种技术优势：（1）成本低,不受伦理限制;（2）体积相对较大,化蛹前的最后一龄幼虫长约2cm,重约250mg,易于操作,便于收集组织/血淋巴用于组织分析;（3）能够注射精确剂量的微生物;（4）可以在20-30℃的任意温度下饲养,感染研究可在15-37℃及高达42℃的温度下进行,符合人类病原体研究的重要的特征（Cotter et al. 2000;Rejasse et al. 2012）。
1.2 大蜡螟幼虫的免疫系统
大蜡螟幼虫的天然免疫系统与哺乳动物的天然免疫系统有许多相似之处。大蜡螟幼虫的免疫应答由细胞免疫和体液免疫组成。细胞免疫由吞噬细胞介导,称为血细胞,血细胞是对入侵病原体产生的细胞免疫应答,同时血细胞与哺乳动物的中性粒细胞的结构和功能高度相似,它可以吞噬及固定病原体,并通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导的呼吸爆发进行杀伤。体液免疫应答包括黑化、调理素和抗菌肽的产生。其中黑化反应是黑色素的形成和沉积,黑化程度根据感染的菌株引起蜡螟体呈现斑点状灰色至均匀的黑色外观,据此特点可直观观察蜡螟体表颜色变化,判断并评价蜡螟的生存情况（Tsai et al. 2016）。
2 大蜡螟幼虫真菌感染模型的种类
2.1 真菌毒力模型
大蜡螟对许多致病的微生物敏感,而且免疫反应在结构和功能上与哺乳动物的天然免疫反应有许多相似之处（Mikulak et al. 2018）。由于大蜡螟易于培养,购买成本低廉,可在48h内获得结果,并且可在短时间内接种大量幼虫（Cotter et al. 2000）,因此可作为有效寄主模型广泛用于毒力因子及其发病机制的研究。Brennan et al.（2002）研究表明大蜡螟幼虫与BalbC小鼠中白念珠菌突变体的毒力测定结果一致,后期研究得出大蜡螟幼虫中影响白念珠菌突变体毒力的因素（Dunphy et al. 2003）。Reeves et al.（2004）用大蜡螟幼虫模型研究病原体的易感程度与毒素的相关性,此外,Renwick et al.（2006）利用大蜡螟幼虫模型研究确定了烟曲霉孢子萌发与毒力之间的相关性。Thomaz et al.（2013）首次使用大蜡螟作为Paracoccidioides lutzii和Histoplasma capsulatum的模型宿主研究双相真菌的毒力,结果表明这些真菌可导致大蜡螟出现多种变化,这说明,大蜡螟可作为研究双相真菌病原体毒力的宿主模型。Bergin et al.（2003,2006）提出大蜡螟幼虫中真菌负荷和血细胞密度的变化可作为评估幼虫真菌毒力的指标,其微生物肽的表达变化可作为感染免疫应答的指标,并有助于区分感染的致病性。目前也常用幼虫死亡作为终点来研究毒力的强弱。无论从哪一方面来研究,都可以在48h内获得结果。显然,使用大蜡螟幼虫可显著缩短实验研究时间,故正确并适当地用大蜡螟幼虫感染模型来研究真菌毒力是一个快速而有效的手段（Mylonakis et al. 2005）。
2.2 真菌致病机制模型
大蜡螟幼虫对感染的适应性以及防御反应的能力使得它成为研究微生物发病机制中的一种有趣的宿主（Fuchs et al. 2010）。大蜡螟已被用于研究新型隐球菌（Mylonakis 2008）、小孢子菌（Wenjun et al. 2010）、红色毛癣菌（Achterman et al. 2011）、念珠菌属（Dunphy et al. 2003）、暗色真菌（Huang et al. 2018）、马尔尼菲青霉菌（Huan et al. 2015）、黄曲霉（Scully & Bidochka 2009）和烟曲霉（Fallon et al. 2011）等多种致病真菌的致病机制。Fuchs et al.（2010）报道了大蜡螟幼虫作为感染模型来研究真菌致病机制的模型动物,以新型隐球菌为例详细介绍了研究方法,比如收集感染后的幼虫血细胞,观察脂肪体和其他内部结构以及真菌丝的状态。此外,不同的真菌与不同宿主免疫细胞产生的相互作用,展示了如何使用荧光激活细胞分选仪（FACS）分析评估真菌细胞-幼虫血细胞的关联。同时,研究丝状体在白念珠菌毒力中的作用,得出单靠丝状体是不足以杀死大蜡螟幼虫的结论,提示可能有其他毒力因子与调节丝状体的基因有关。研究真菌细胞与昆虫血细胞的关系,并以同源性为例说明了该方法的应用,因此,大蜡螟已经被证实是研究白念珠菌和新型隐球菌毒力和致病性的替代模型宿主。Coleman et al.（2011）用大蜡螟幼虫作为异源宿主对镰刀菌发病机制进行了研究,提出温度因素、镰刀菌株注射浓度、分生孢子形态均影响毒力,其中大孢子比小孢子毒力强的结论。Mukherjee & Vilcinskas（2018）分析证实了病原体对宿主衍生的防御分子反应的特异性,并将该过程与组蛋白乙酰化/脱乙酰化的表观遗传调控相关联。这一系列反应表明,病原体和宿主的共同进化可能与一系列复杂的防御反应有关,这些防御反应基于入侵的真菌病原体与其昆虫宿主之间的关系。
2.3 抗真菌体外药物敏感实验模型
大蜡螟幼虫血细胞和哺乳动物的中性粒细胞已被证实以类似的方式吞噬和杀死病原体,这些相似性使大蜡螟幼虫被广泛地用作研究人类微生物病原体毒力和体内筛选抗微生物药物功效的模型（Kavanagh & Reeves 2010）。根据研究成果,评估微生物毒性或筛选抗菌药物的功效,其结果与哺乳动物所能获得的结果一致（Brennan et al. 2002）。Binder et al.（2016）研究发现,抗真菌药物在哺乳动物感染模型和大蜡螟感染模型中的疗效有很高的相关性。Mylonakis et al.（2005）用大蜡螟幼虫建立新型隐球菌的感染模型,研究评估新生隐球菌感染后两性霉素B、氟胞嘧啶和氟康唑的抗真菌活性。Maurer et al.（2015）调查了是否可以用大蜡螟感染模型替代体内模型研究两性霉素B对土曲霉分离菌株的体内抗真菌功效,并发现两性霉素B最低抑菌浓度（MIC）为0.5mg/L的分离菌株比两性霉素B最低抑菌浓度（MIC）>4mg/L的分离菌株毒性更强。Kelly & Kavanagh（2011）研究检测了卡泊芬净降低大蜡螟幼虫白念珠菌感染的能力,证明了该药物能够引发昆虫的免疫反应。Staniszewska et al.（2018）进行了有关新的四唑衍生物-6a的活性研究,在对大蜡螟幼虫接种白念珠菌的前30min和1h使用单剂量的复合物显著提高了幼虫的存活率。在接种后30min和1h监测实验组幼虫的存活能力增加。新的四唑衍生物-6a有效抑制感染并提高了幼虫的存活时间,可高达18h。这些研究结果提示大蜡螟幼虫也可成为研究评价抗真菌剂与免疫或毒力调节药物结合而成为创新治疗策略的有希望的宿主。
3 大蜡螟感染模型的实验研究方法
据报道,幼虫的虫龄、摄食状况和物理因素对幼虫感染的易感性有显著的影响（Mowlds & Kavanagh 2008;Banville et al. 2012）。因此用于进行实验研究可选取由幼卵发育而成的5周左右幼虫,长约2-2.5cm,颜色相近,通身体表呈奶油色的幼虫。使用前储存在15℃的环境下,建议感染前将幼虫停止喂养24h（Ramarao et al. 2012）。接种前应避免在低于4℃温度下冷却孵育的做法,因为已证明这种做法会改变幼虫的免疫反应并可能会影响实验结果（Mowlds & Kavanagh 2008）。
实验中最常用的感染方法是注射感染幼虫（Champion et al. 2018）,可通过左侧肢体或皮肤注射（Cotter et al. 2000）,也有经口腔感染的模型,但是它的缺点是难以精准到感染剂量（Fedhila et al. 2010）。微生物应在感染前进行清洗,尽量减少在体外生长过程中有害因素对微生物的影响,并且建议使用PBS作为对照,因为注射时可能会造成虫体的直接创伤（Andrew & Peter 2011）。在每种实验条件下,应至少使用10-20只幼虫,感染后环境温度应该保持在37℃的环境下（Konkel & Tilly 2000）。目前在许多研究当中,把用作爬行动物、鸟类饲料以及鱼饵的商业幼虫当做实验模型（Cook & McArthur 2013）。因此,大部分幼虫体内可能会有抗生素和激素的残留（Buyukguzel & Kalender 2007）。当用于实验研究的幼虫来源不明时,可能会导致幼虫对感染的反应不一致,最终不能确定实验结果的可靠性和可重复性（Cook & McArthur 2013）。为了解决这些问题,现提出标准化的大蜡螟幼虫,这些幼虫不添加抗生素或激素,适用于研究,虫龄及体重也被标准化;其次幼虫的角质层被净化,减少了注射PBS对照动物的感染问题,提高了实验结果的准确性（www.BioSystemsTechno logy.com）。
当大蜡螟幼虫作为研究真菌毒力的模型时,一般在5d内进行毒力评估,评估标准一般为幼虫的活动性或身体对刺激反应能力的大小,最终将幼虫的死亡作为终点（Champion et al. 2018）,如注射后1h、2h、6h、12h、24h、2d、3d、4d、5d等时间段进行观察记录并统计,当幼虫被注射多种不同浓度的剂量时,根据评估标准对幼虫感染后情况进行分析,经过统计可以计算出半致死剂量（Vilmos & Kurucz 1998）。但是,以这种方式对死亡进行频繁间隔的监测耗时较大,因此,通常每隔12h或24h对幼虫进行记分,虽然这样监测可以在一定程度上减少工作量,但也有可能错过具体死亡时间,细微差别将导致不同结果。其他评估感染后的毒力程度的方法包括记录幼虫虫体外观的变化,如大小及长度的变化、外观颜色的变化及茧形成等。这些方法各有优缺点,根据经验,感染的严重程度取决于致病菌毒力的强弱。有些病原体造成均匀且较深的黑化,而另一些则导致更微弱的颜色变化,造成这种变化的原因值得进一步研究分析（Champion et al. 2018）。由于缺乏以上影响实验结果的质量控制的差异及评价的标准化,Loh et al.（2013）提出了大蜡螟健康指数评分系统。此评分系统为了获得幼虫健康状况的更细微的差异,将每个蜡虫根据4个主要观察结果进行评分：活动度、茧形成、黑化和存活。根据这些指标的赋分高低来评价蜡虫的健康程度。
4 总结与展望
大蜡螟幼虫作为感染性疾病研究的动物模型被普遍认可,其免疫系统与哺乳动物的固有免疫系统高度相似,大蜡螟幼虫可以用于评估致病性真菌的毒力。虽然大蜡螟是无脊柱动物,但与脊柱动物模型相比,它具有可大量繁殖、实验成本低廉、易于保存、操作简单、实验周期短等特点,而且不需要伦理审查。大量致病菌需要毒力筛查时,大蜡螟感染模型是合适的选择。大蜡螟属于昆虫,与人体结构上存在着极大的差别,限制了其发展的空间。大蜡螟的真菌感染模型在某些方面利于人体抗真菌及相关药物的研究,可用于真菌毒力的初步评估、真菌感染后的动态的病理过程、以及不同真菌感染后的不同时间段的存活率等方面的研究。
（本文责编：韩丽）
参考文献
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