蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Fr.又名北冬虫夏草,具有多种生物学活性成分,是一种重要的药食用真菌（戴玉成和杨祝良2008;戴玉成等2010）,已被我国卫生部纳入新资源食品行列（董彩虹等 2016）。虫草素（cordycepin）是蛹虫草中主要的有效成分之一,又名虫草菌素、3’-脱氧腺苷。它是由腺苷和含有碳支链的脱氧戊糖构成的一种核苷类似物（Wu et al. 2014）,属嘌呤类生物碱。早在20世纪中叶,虫草素就从人工栽培的蛹虫草的培养滤液中被发现并命名（Cunningham et al. 1951）,是首个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草素有多种药理学作用,除具有抗肿瘤（李佳佳等 2019）、抗病毒、抗菌、增强免疫力等多种功效（王长文等 2019）,虫草素还能降血脂血糖（Ma et al. 2015;Wu et al. 2019）,还能用于治疗肺部、肾脏和胃部等疾病（崔琳琳等 2019）。虫草素作为一种天然来源的抗肿瘤有效成分,可用作抗肿瘤药物的辅助药物,从而提高抗肿瘤药物本身药效（刘桂君等 2013）。
乳腺癌（breast cancer）是女性中最常见、发病率最高的恶性肿瘤之一,位居女性癌症发病之首（Siegel et al. 2020）。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）作为乳腺癌中的一种分型,约占所有乳腺癌病理类型的15%-20%（张继博等 2017）,是指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2的表达均为阴性的乳腺癌（陆国芬等 2016）。目前,由于三阴性乳腺癌具有死亡率高、预后效果差、易复发等特点,已成为乳腺癌研究的重中之重。在肿瘤治疗过程中逐渐发现,单用某一种药物早已无法达到控制癌细胞增殖的效应。因此,联合用药疗法对抗肿瘤开辟了新思路。联合用药能够调节不同蛋白,克服生物网络中的冗余性,减少抗性的产生,从而提高治疗功效（杨琛 2016）。为筛选出具有协同作用的药物组合、降低化疗药物的毒副作用、提高防治肿瘤的效力,与天然产物联用已成为当前治疗肿瘤可行的手段之一（Lu et al. 2017）。相关研究显示,虫草素与抗肿瘤一线药阿霉素均具有抗肿瘤的效应,且近些年多项研究提示两者抑制肿瘤的作用机制均可诱导肿瘤细胞发生凋亡,但一直以来对联合应用这两种药物的研究鲜有报道。本研究先探讨了虫草素与阿霉素联合使用的效应,再从体外检测两者使用对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其毒副作用,充分挖掘虫草素的抗肿瘤潜力。通过探讨虫草素与阿霉素的联合药效,丰富了蛹虫草中药效活性物质的理论基础,对乳腺癌的治疗具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验材料：人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株,购于赛百慷生物技术股份有限公司。
1.1.2主要试剂：虫草素、四甲基偶氮唑盐（MTT）购于美国Sigma公司;RPMI 1640培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素购于美国Gibco公司;DNA Ladder凋亡试剂盒、Hoechst- 33258染色试剂盒购于碧云天生物技术公司;胰酶购于北京索莱宝科技有限公司;二甲基亚砜、氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钾购于国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 实验仪器：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、多功能酶标仪、液氮研磨仪、超纯水设备、离心机、电热恒温水浴锅等。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清和1%（V/V）青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液在37℃、5% CO2饱和湿度恒温培养箱中进行传代培养。
1.2.2 MTT法检测细胞活力：取对数生长期的MDA-MB-231细胞以5×104个/mL密度接种于96孔板中,每孔100μL。待细胞贴壁后进行分组处理。药物处理组分别设置为：（1）虫草素组（COR）,各孔培养液虫草素浓度分别为20、40、80、120、200μmol/L;（2）阿霉素组（DOX）,各孔培养液阿霉素浓度分别为0.1、0.5、1、2、5μmol/L;（3）虫草素与阿霉素联合组（COR+DOX）,两种药物浓度分别为20+0.1、40+0.5、80+1、120+2、200+5μmol/L,同时设置不加药的对照组（CK）以及无细胞的调零孔,每组设6个重复孔,置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h;弃培养液,加入浓度为5g/L MTT 20μL/孔,继续培养4h后弃去上清,每孔再加入150μL DMSO,振荡15min,直至紫褐色沉淀（MTT还原产物）完全溶解。采用酶标仪测定各孔在490nm波长处各孔吸收度（OD值）,并计算不同时间段MDA-MB-231细胞存活率。细胞存活率(%)=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。同时运用CalcuSyn Demo 2.0软件计算出不同浓度下两个药物的联合作用指数（CI）。
1.2.3 显微观察细胞形态：选择对数生长期的MDA-MB-231细胞用胰酶消化10-30s后,加入血清培养液1 000r/min离心3min,弃上清;每孔吸取1mL细胞悬液（1×104个/mL）,接种于6孔培养板中,细胞贴壁展开后,在设置的处理组中分别加入含虫草素（80μmol/L）、阿霉素（1μmol/L）和虫草素+阿霉素（80μmol/L+ 1μmol/L）的培养液,终体积为2mL,对照组中加入等体积的培养液,每组3个复孔,于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养48h。在200倍显微镜下观察记录各组乳腺癌细胞的生长形态。
1.2.4 平板克隆形成实验：将对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔培养板（同1.2.3）过夜培养;待细胞贴壁展开后,进行分组处理（操作同1.2.3）,培养基3d更换一次,培养7-14d左右,当观察到集落中的细胞数目大于50,终止培养;除去培养液,PBS缓慢冲洗3次,用2mL无水甲醇固定30min后,加入0.1%的结晶紫,室温染色30min后吸去,PBS润洗3次至无明显紫色背景,室温下自然晾干,拍照,并利用Image J软件计数分析克隆形成率。克隆形成率(%)=实验组的克隆数/对照组的克隆数×100%。
1.2.5 Hochest 33258染色检测细胞凋亡形态变化：取对数生长期的MDA-MB-231细胞以1×104个/孔接种于6孔板中,过夜培养;进行分组处理（同1.2.3）,培养48h后弃培养液,加入固定液,10min后吸除,PBS洗涤2次;加入500μL Hoechst 33258染色液避光染色5min后,用PBS缓冲液缓慢冲洗2次。放置在激发波长350nm、发射波长460nm的倒置荧光显微镜下观察统计并拍照,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞/(正常细胞+凋亡细胞)×100%。
1.2.6 DNA Ladder检测细胞凋亡：将对数生长期的MDA-MB-231细胞胰酶消化并涡旋振荡重悬后,计数稀释,按每孔5×105细胞量接种至6孔板中,37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞贴壁展开后,分别设置对照组和实验组,同1.2.3,继续培养48h;弃培养液,胰酶消化,PBS冲洗1次,1 000r/min离心2min;加裂解液振荡混匀,50℃水浴过夜;加入500μL Tris平衡苯酚（pH 8.0）,4℃下12 000r/min离心5min,缓慢吸取上层,再重复此步骤;吸取上层水相,在无菌离心管中加入等体积氯仿抽提一次;吸取上清,加入10mol/L醋酸铵60μL和无水乙醇600μL,混匀,置于-20℃下1h;在4℃、12 000r/min离心5min,弃上清后加入600μL 70%乙醇,振荡再离心,除上清,立即加入50-100μL TE Buffer溶解DNA,采用1%琼脂糖凝胶电泳分析抽提到的DNA样品,拍照。
1.2.7 细胞划痕愈合实验：将对数生长期的MDA-MB-231细胞用胰酶消化并重悬为单细胞悬液后,在显微镜下计数后将细胞稀释至1×104个/mL,接种在已做好标记线的6孔细胞培养板中,每孔接种1mL,待细胞单层铺板至80%-90%后,吸除培养液;用10μL灭菌枪头尖端垂直于孔后的标记线划痕,PBS缓慢冲洗3次;处理组中分别加入含虫草素（80μmol/L）、阿霉素（1μmol/L）和虫草素+阿霉素（80μmol/L+1μmol/L）的2.5%血清培养基,对照组中只加入含2.5%血清的培养基,各组加入的培养基等量;置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h,并在倒置显微镜下拍照记录各组在0h的原划痕宽度和48h的现细胞划痕宽度,即为细胞划痕愈合情况,并计算细胞迁移率。细胞迁移率(%)=(原划痕宽度-现划痕宽度)/原划痕宽度×100%。
1.3 统计分析
采用SPSS 23.0进行数据分析,不同处理组之间比较采用t检验,实验数据以‾x±s表示,P<0.05表示显著差异,P<0.01表示极显著差异。
2 结果与分析
2.1 虫草素联合阿霉素的协同效应
通过MTT实验考察虫草素和阿霉素对MDA-MB-231细胞增殖的影响。与对照组相比,不同浓度的虫草素和阿霉素均能抑制MDA-MB-231细胞的增殖,随处理浓度的增加,MDA-MB-231的细胞活力显著下降,呈现出一定的量效关系,200μmol/L虫草素作用细胞后,细胞抑制率为64.51%±1.62%;5μmol/L阿霉素作用细胞后,细胞抑制率达到62.46%±1.53%;且当虫草素（80μmol/L）、阿霉素（1μmol/L）及二者联合作用后,对细胞的抑制率分别为28.76%±0.70%、43.62%±5.01%和60.31%±1.06%（图1A）。综上,在供试浓度范围内,虫草素、阿霉素均能有效抑制三阴性乳腺癌的细胞活力,当二者联合作用后对细胞的抑制作用更强,随供试浓度的增加而增强。
图1
图1
联合用药对MDA-MB-231细胞抑制的影响
A：细胞活力;B：联合用药指数
Fig. 1
The effects of combined medication of cordycepin and doxorubicin on MDA-MB-231 cell inhibition.
A: Cell viability; B: Combination index.
再通过Chou-Talalay法运用CalcuSyn Demo 2.0计算各联合用药组的CI值（CI=1、<1或>1表示为药物的相加、协同和拮抗作用）（Matthews et al. 2017）。虫草素联合阿霉素抗MDA-MB-231细胞时具有协同效应。经分析发现,20μmol/L虫草素和0.1μmol/L阿霉素的CI值最小,为0.511,但在此浓度下,两种药物联合作用后细胞抑制率未超过50%,只达到30.00%±3.92%,作用不明显,不便于观察,因此,为利于后续研究,选择CI=0.665的80μmol/L虫草素和1μmol/L阿霉素联用（图1B）。
2.2 联合用药对细胞形态的影响
为更直观地反映虫草素和阿霉素对MDA-MB-231细胞的毒性作用,进行了显微观察细胞形态变化。经80μmol/L虫草素和1μmol/L阿霉素联合作用处理48h后,在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。结果表明,虫草素组的MDA-MB-231细胞皱缩、逐渐变圆,对细胞有一定抑制作用;阿霉素组存在少量漂浮的凋亡细胞,贴壁细胞数目大幅减少,较虫草素组对细胞的抑制作用强;联合组中所有细胞明显出现皱缩、变圆及脱落的现象,还可观察到许多凋亡细胞和凋亡小体;与各处理组相比,对照组细胞形态规则,细胞布满整个视野。综上,在供试浓度下,单一使用虫草素、阿霉素对MDA-MB-231细胞均具有一定的毒性,且虫草素联合阿霉素作用后对细胞的毒性较单一作用更明显（图2）。
图2
图2
联合用药对MDA-MB-231细胞形态的影响
A：对照组;B：虫草素组;C：阿霉素组;D：虫草素+阿霉素组
Fig. 2
The effects of combined medication of cordycepin and doxorubicin on cell morphology of MDA-MB-231.
A: Control group; B: Cordycepin treatment group; C: Doxorubicin treatment group; D: Cordycepin+doxorubicin treatment group.
2.3 联合用药对细胞增殖的影响
为进一步研究虫草素与阿霉素联合作用对MDA-MB-231细胞增殖的影响,细胞克隆实验结果显示,与对照组相比,给药组的细胞增殖数目显著减少,各组克隆形成能力由高到低依次为对照组>虫草素组>阿霉素组>联合组;经Image J软件计数分析发现,给药组的细胞克隆的能力受到明显抑制（P<0.01）,虫草素组、阿霉素组及联合组的克隆形成率分别为48.93%±1.72%、23.72%±0.65%和7.03%± 1.19%,这表明,联合用药抑制细胞增殖作用更强（图3）。
图3
图3
联合用药对MDA-MB-231细胞增殖的影响
A：细胞增殖;B：克隆形成率. a：对照组;b：虫草素组;c：阿霉素组;d：虫草素+阿霉素组. 下同. 与对照组相比,&P<0.05,&&P<0.01;与虫草素组相比,@P<0.05,@@P<0.01;与阿霉素组相比,#P<0.05,##P<0.01
Fig. 3
The effects of combined medication of cordycepin and doxorubicin on MDA-MB-231 cell proliferation.
A: Cell proliferation; B: Colony formation rate. a: Control group; b: Cordycepin treatment group (COR); c: Doxorubicin treatment group (DOX); d: Cordycepin+doxorubicin treatment group (COR+DOX). The same below. Compared with the control group, &P<0.05, &&P<0.01; compared with cordycepin group, @P<0.05, @@P<0.01; compared with doxorubicin group, #P<0.05, ##P<0.01.
2.4 联合用药对细胞凋亡的影响
通过Hoechst-33258染色实验可以观察到不同浓度虫草素和阿霉素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。对照组细胞的荧光强度较弱,细胞核数目较多、形态规则、分布均匀;与对照组相比,单一药物作用组（80μmol/L虫草素、1μmol/L阿霉素）细胞荧光变亮,细胞数量明显减少,部分细胞核明显皱缩变小、染色质聚集;联合组荧光透亮、细胞核形态固缩或分裂、核凝聚变小,有的细胞核碎裂为诸多小块细胞核（图4A）。经统计分析,通过给药处理后,3组均能有效诱导细胞的凋亡（P<0.01）,联合组的作用更强,细胞凋亡率最高,为78.52%±11.18%,阿霉素组的细胞凋亡率为60.00%±10.00%,虫草素组的细胞凋亡率为41.11%±8.39%（图4B）。
图4
图4
联合用药对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
A：Hoechst-33258染色;B：细胞凋亡率. 与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01
Fig. 4
The effects of combination therapy on apoptosis of MDA-MB-231 cells.
A: Hoechst-33258 staining; B: Apoptosis rate. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
利用DNA Ladder凋亡检测进一步明确虫草素和阿霉素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。对照组条带单一,未出现DNA Ladder;与对照组相比,处理组细胞均出现了一定程度的凋亡特征性DNA Ladder,其中联合组的细胞凋亡特征性DNA Ladder较其他组更多。以上表明,供试浓度下联合用药能有效诱导MDA-MB-231细胞凋亡（图5）。
图5
2.5 联合用药对细胞迁移的影响
图6
图6
联合用药对MDA-MB-231细胞迁移的影响
与对照组相比,&P<0.05,&&P<0.01;与虫草素组相比,@P<0.05,@@P<0.01;与阿霉素组相比,*P<0.05,**P<0.01
Fig. 6
The effects of combination therapy on MDA-MB-231 cell migration.
Compared with control group &P<0.05, &&P<0.01; compared with cordycepin group @P<0.05, @@P<0.01; compared with doxorubicin group, *P<0.05, **P<0.01.
3 讨论
虫草素作为核苷类新药,具有免疫调节和抗真菌等作用。能干扰细胞RNA和DNA的合成从而抑制癌细胞分裂,具有修复基因细胞的特殊功能（雷坤 2012）。近年来,有关虫草素的作用机制和抗癌活性的研究已成热点。Park et al.（2017）利用免疫印迹法来测定虫草素的抗肿瘤活性,研究结果表明虫草素可能是通过调节p85/AKT或GSK 3β-r来抑制癌细胞的增殖。Aramwit et al.（2015）从体外致突变性和体内急性毒性试验发现,虫草素是非致突变和无毒的化合物,对A549肺癌细胞具有潜在的抗增殖和抗迁移作用。本实验室研究发现虫草素可有效干预胰腺癌干细胞的增殖及迁移,诱导其凋亡,也首次研究了虫草素抑制Hedgehog途径,从而有效抑制乳腺癌细胞生长（刘建兵等 2017;Liu et al. 2020）。董佳丽（2018）证实了虫草素可诱导乳腺癌细胞的凋亡,具辐射增敏作用。且有研究还发现虫草素联合阿霉素使用可以明显增强阿霉素激活EBV裂解感染能力及对EBV阳性肿瘤细胞杀伤能力（杜银平 2017）。此外,Du et al.（2016）报道了虫草素与阿霉素联合使用在抑制SCID小鼠的EBV阳性肿瘤生长方面比阿霉素单独使用更有效。这表明虫草素在体内亦能发挥影响。
在肿瘤临床治疗上,长期给予单一药物,机体可能会通过基因突变、蛋白质表达变化、干细胞靶点表达缺失等机制逃避抗癌药物的杀伤作用,从而形成耐药性（Gordon & Nelson 2012）,而联合用药通过发挥药物的协同作用,既能增加药物抗肿瘤效果同时又能降低化疗药物毒副作用,达到提高药效、降低毒性、减少耐药性的目的（Tortora et al. 2007）。区俊文（2017）证实姜黄素联合VitC作用可抑制人源性三阴乳腺癌细胞增殖、侵袭,且诱导凋亡的功效较单一使用更显著。虫草素联合其他抗癌药使用能显著增强其抗肿瘤活性。樊华等（2019）通过实验证明虫草素与化疗药物吉西他滨具协同抗癌效应,两者联合使用能显著干预乳腺癌细胞凋亡诱导,其作用机制与Akt信号通路的活化有关。本研究结果表明,在供试浓度下,虫草素联合阿霉素能抑制MDA-MB-231细胞的活力,且二者联合作用后对细胞的抑制作用较单一药物的作用更明显,具有协同效应。同时证实虫草素与阿霉素联合作用抑制了三阴性乳腺癌细胞增殖与迁移,诱导其凋亡,与前人报道虫草素抑制肿瘤细胞活性的研究一致。这为进一步探索虫草素与阿霉素联合作用干预乳腺癌在生物体内的影响奠定基础。
参考文献
Toxicity evaluation of cordycepin and its delivery system for sustained in vitro anti-lung cancer activity
DOI:10.1186/s11671-015-0851-1 URL [本文引用: 1]
Research progress on pharmacological effects of cordycepin
Cordycepin, a metabolic product from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link. Part I. Isolation and characterisation
A revised checklist of medicinal fungi in China
A revised checklist of edible fungi in China
Cordyceps industry in China: current status, challenges and perspectives— Jinhu declaration for cordyceps industry development
Study of radiosensitivity and underlying mechanisms of cordycepin on breast cancer cells
Study on the mechanism and application of EBV lytic infection induced by cordycepin and doxorubicin
Cordycepin enhances Epstein-Barr virus lytic infection and Epstein-Barr virus-positive tumor treatment efficacy by doxorubicin
DOI:10.1016/j.canlet.2016.04.001 URL [本文引用: 1]
Effect of cordycepin combined with gemcitabine on apoptosis of breast cancer cells and its mechanism
Cellular senescence and cancer chemotherapy resistance
DOI:10.1016/j.drup.2012.01.002 URL [本文引用: 1]
Study on induction apoptosis and inhibition of the proliferation on tumor cell of cordycepin
Research progress on anti-cancer activity of cordycepin in Cordyceps militaris
Natural cordycepin induces apoptosis and suppresses metastasis in breast cancer cells by inhibiting the Hedgehog pathway
Research process of cordycepin in Cordyceps militaris
The mechanism of cordycepin in inhibition of pancreatic cancer stem cells proliferation and metastasis
Drug combination in clinical cancer treatments
Clinicopathologic characteristics and prognosis of triple negative breast cancer in China: a Meta analysis
Cordycepin from Cordyceps militaris prevents hyperglycemia in alloxan-induced diabetic mice
DOI:10.1016/j.nutres.2015.04.011 URL [本文引用: 1]
Investigating antimalarial drug interactions of emetine dihydrochloride hydrate using CalcuSyn-based interactivity calculations
DOI:10.1371/journal.pone.0173303 URL [本文引用: 1]
Anticancer efficacy of Cordyceps militaris ethanol extract in a xenografted leukemia model
Clinical study and mechanism study of curcumin in combination with vitamin C on triple negative breast cancer
Cancer statistics, 2020
DOI:10.3322/caac.v70.1 URL [本文引用: 1]
Overcoming resistance to molecularly targeted anticancer therapies: rational drug combinations based on EGFR and MAPK inhibition for solid tumours and haematologic malignancies
DOI:10.1016/j.drup.2007.03.003 URL [本文引用: 1]
Research progress of cordycepin in Cordyceps militaris
Resource diversity of Chinese macrofungi: edible, medicinal and poisonous species
DOI:10.1007/s13225-019-00432-7 URL [本文引用: 1]
Cordycepin down-regulates multiple drug resistant (MDR)/HIF-1α through regulating AMPK/mTORC1 signaling in GBC-SD Gallbladder cancer cells
DOI:10.3390/ijms150712778 URL [本文引用: 1]
Precision drug combination discovery based on target network analysis and the construction of PDCP web server
Advances in treatment of triple negative breast cancer
我国虫草产业发展现状、问题及展望——虫草产业发展金湖宣言
