羊肚菌隶属于子囊菌门Ascomycota、盘菌纲Pezizomycetes、盘菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae、羊肚菌属Morchella（Kirk et al. 2008）,又名阳雀菌、狼肚菌、麻子菌等。羊肚菌因其味道鲜美、营养丰富、具多种药用功能（Wu et al. 2019）和经济价值高等特点近年来在国内备受关注,其栽培面积虽然大幅提升（贺国强等 2021）,但产量很不稳定,大面积绝收情况时有发生（Liu et al. 2018）,主要原因在于很多基础生物学问题不明（刘奇正和董彩虹 2020）。

国内外学者已对羊肚菌的人工栽培进行了不懈地尝试和探索。直到1982年,Ower利用菌核为种源在室内栽培获得了羊肚菌子实体（Ower 1982）,在条件优化的基础上,该栽培技术相继获得了美国专利（Ower et al. 1986, 1988, 1989）。我国羊肚菌栽培的主要技术要点有品种技术、营养袋技术和栽培管理技术,其中品种是基础,外营养袋既是核心（谭方河 2019）,也是国内羊肚菌大田栽培成功的关键。直接将营养料添加到大田中被证实不可行,必须使用外营养袋补给方式才能获得好的吸收效果（谭方河 2019）。

在羊肚菌的种植过程中,约有20%-50%的工作量与生产成本集中在外源营养袋这一环节（刘伟等 2017;贾乾义等 2020）。李涛等（2018）从羊肚菌生活史、菌核形成的调控模式、营养转运机制等方面,对外源营养袋的作用机制进行了综述,认为外源营养袋的营养配比和摆放时间对羊肚菌生产至关重要,但是缺乏具体实验依据。外源营养袋通常以小麦、棉籽皮、稻壳、木屑、玉米芯、麸皮等为原料（贺新生 2017）。目前,专门对外源营养袋配方的研究报告相对较少,苗人云等（2020）在对六妹羊肚菌Morchella sextelata M. Kuo的研究中,报道其最佳配方（重量比）为麦粒79%、谷壳19%、石灰1%、石膏1%。何俊等（2020）报道适合梯棱羊肚菌Morchella importuna M. Kuo et al.的营养袋优质配方为：小麦58%、阔叶树木屑30%,腐质土10%、石膏1%、石灰1%。然而,大部分栽培从业者在实际应用中并没有对栽培物种进行区分,且使用配方也各不相同（贺新生 2017;贾乾义等 2020）。生产中用料缺乏规范性的指导,给羊肚菌的栽培生产埋下隐患。

目前的研究仅证明了外源营养袋可向田间生长的羊肚菌菌丝及子实体补充营养,但有关其作用机理和影响因素等尚未完全解析。Tan et al.（2019）通过多组学分析发现CAZy家族对羊肚菌分解营养物质具有重要作用,并且验证了碳源从外源营养袋转移到土壤中的过程。代俊杰（2018）发现营养袋添加时间越早则出菇越早,菇体的初采时间和营养袋的添加时间呈显著正相关。对于外源营养袋的使用,虽有一些装袋形式、添加方式和摆放样式等的研究,但在实际中各栽培户多以自身经验为主,缺乏科学依据,没有形成系统化的技术流程,严重阻碍了羊肚菌的可持续、健康发展。

外源营养袋作用机制的解析对于羊肚菌栽培技术的优化乃至升级至关重要。田间实验因其生产周期长、实验成本高等,不便于开展对外源营养袋作用机理的深入研究。因此,本研究建立了一种在室内易于实现的外源营养研究模型,拟通过该模型对梯棱羊肚菌利用外源营养的基本特征和利用效果的影响因素进行研究,旨为规范和优化外源营养袋的技术提供理论支撑。

1.1.1 供试菌株：梯棱羊肚菌菌株CGMCC 5.2196保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂：琼脂购自宝如亿（北京）生物技术有限公司;葡萄糖,硫酸镁,磷酸二氢钾,购自国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨购自安琪酵母股份有限公司。

将10mL培养基倒入90mm平皿,凝固后备用,作为主培养基;将定量体积培养基倒入60mm培养皿,凝固后备用,取固定大小作为外源营养模块（exogenous nutrition module,ENM）。

使用接种钩将菌种块接种到平皿中央,20℃培养箱培养,在设定的时间点将ENM模块放到主培养基上相应位置,正置培养3d后再倒置培养。

1.4.1 主培养基组成：分别以马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和1/5 PDA（将马铃薯葡萄糖液体培养基原液稀释5倍后加入1.8%琼脂）作为主培养基,研究主培养基组成对外源营养的作用。

1.4.2 ENM摆放时间：根据实验设置时间点,分别在菌丝生长至1/2平皿、刚长满平皿、菌核起始期、菌核发育期加入ENM。如无说明,为在菌核起始阶段加入ENM。

1.4.3 营养袋包装和划口：按照无包装,聚丙烯袋（划口：3道2cm口,刺孔：10个1mm直径孔）,滤纸袋（划口：3道2cm口）,铝箔袋（划口：3道2cm口）方式进行包装、备用。

1.4.4 ENM碳氮比：以葡萄糖3%、蛋白胨1%、硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.3%、琼脂1.8%为基础培养基,调节蛋白胨的用量,配制碳氮比分别为10:1、20:1、40:1和60:1的培养基作为ENM,蛋白胨的添加量分别为1%、0.48%、0.24%和0.16%。

将主培养基或者ENM模块放入锥形瓶中,加入3-5倍体积水后加热充分融化,趁热用1层纱布过滤,将滤布上菌丝体转移到滤纸上,45℃烘干至恒重后称量记录。

所得结果以平均值和标准差表示。利用SPSS 24.0软件对数据进行单因素方差分析（Anova）和LSD检验,P<0.05为差异显著。

通过对羊肚菌的大田栽培中外源营养袋摆放情况（图1A）的分析和模拟,本研究建立了一种外源营养添加对梯棱羊肚菌生物量影响的模型（图1B）,主要分为两部分,一部分是10mL培养基铺满整个培养皿作为主培养基,模拟田间栽培中的厢面土壤,另一部分是后添加的外源营养模块（ENM）,模拟栽培中的外源营养袋。

利用该模型,以1/5 PDA为主培养基,对照组不添加外源营养（EN）,实验组分别添加的EN量为10mL PDA和20mL PDA（图1C）。添加EN与无添加组相比,主培养基内菌丝的生长更旺盛。培养结束后,分别收集主培养基内的生物量发现：添加EN后主培养基内的生物量显著增加,且EN添加量为20mL时,主培养基的生物量显著高于EN 10mL（图1D）。另一方面,将EN为10mL PDA组主培养基内的菌丝和菌核分开收集并称重,显示主培养基内生物量主要集中于菌核（图1E）,表明菌核对于梯棱羊肚菌储存来自EN的物质具有重要作用。

为了研究梯棱羊肚菌对EN的利用与主培养基成分是否有关,采用1/5 PDA和PDA作为主培养基,分别添加20mL PDA作为EN,发现在添加相同EN的情况下,以1/5 PDA为主培养基时生物量的增加量显著高于以PDA为主培养基（图1F）,表明主培养基营养贫瘠时,EN能更有力地促进梯棱羊肚菌生长。

在大田生产中,外源营养袋何时摆放主要根据经验而定,尚不清楚外源营养摆放时间对栽培的影响。本研究利用上述模型,以1/5 PDA为主培养基进行试验。将EN的添加时间设计为4个时间点,即菌丝生长至约1/2平皿（第3天）、菌丝刚长满平皿（第4天）、菌核起始阶段（SI,第5天）和菌核发育阶段（SD,第6天）。在不同时间点添加EN后,培养效果见图2A,在菌丝没长满阶段添加EN组的菌核分散于整个平皿,菌丝刚长满就添加的菌核有部分围绕ENM形成,SI及SD阶段添加则菌核主要围绕ENM形成。生物量数据显示,在菌丝未长满及刚长满平皿时,添加EN的主培养基生物量小于SI和SD阶段添加,SI阶段添加时生物量最大。

针对ENM的摆放位置以及同量分散为不同块数的条件下,本研究对主培养基内生物量的增加情况进行检测,发现这些因素对主培养基内的生物量没有显著影响（图2B-2D）。

实际生产中,外源营养主要使用聚丙烯袋进行包装。本研究以聚丙烯材料对ENM进行包装,以不包裹ENM为对照组,分别在添加EN后的3、6、9和12d时,对主培养基和ENM内的生物量进行检测、分析。添加聚丙烯包裹的ENM后,菌核主要在ENM下方形成且形态不规则,ENM无包裹时菌核主要围绕ENM形成（图3A）。主培养基中生物量检测结果显示,添加聚丙烯包裹的ENM时,主培养基内生物量增加显著慢于添加无包裹ENM,且最后增加量也显著低于无包裹ENM（图3B）。但是对ENM中生物量进行检测,发现了不同的趋势,即聚丙烯包裹的ENM内形成的生物量大于无包裹ENM（图3C）。将主培养基及ENM内生物量相加,即为相同物料情况下形成的总生物量,发现无包裹ENM添加时增速快,但最终形成的总生物量两组之间没有显著性差异（图3D）。

聚丙烯袋在实际使用中需要回收,以防白色污染,寻求其他环境友好型的替代材料也是值得关注的问题之一。本研究选用滤纸和铝箔纸包裹ENM进行了外源营养添加实验（图4A）,结果表明主培养基的生物量增长与聚丙烯袋包裹相比没有显著性差异。同时,对ENM与主培养基的接触面积进行了比较,分为划口和刺孔,从培养效果看,刺孔时主培养基中生物量增长幅度小于划口（图4B）,但没有显著性差异。

本研究制作了不同碳氮比的ENM,研究主培养基对不同碳氮比外源营养的利用情况。添加低碳氮比（10:1）ENM时,菌核分散于整个平皿,而添加高碳氮比ENM后菌核形成相对集中（图5A）。主培养基生物量在添加不同碳氮比ENM后增长情况不同（图5B）,碳氮比高的组别（40:1和60:1）增加量低于低碳氮比的两组,且在本研究中,20:1组的增长量最大,说明ENM的碳氮比对主培养基中羊肚菌利用外源营养有较为显著的影响。

谭方河（2019）综述了外源营养袋技术的由来和发展历史,何俊等（2020）报道指出外源营养料直接施加和装袋施加后的效果有显著差异,Tan et al.（2019）通过多组学等手段研究了外源营养袋向土壤中菌丝提供营养的过程,虽然外源营养袋的相关研究已有不少,但外源营养袋的机制和影响因素仍不清楚。

本研究在实验室条件下建立外源营养模型,通过模型研究发现,在总物料一致的情况下,EN包裹和不包裹两组之间,虽然最终形成的总生物量没有显著差异,但在主培养基和ENM内的生物量存在相反的趋势。聚丙烯袋包裹EN组的主培养基内生物量增速慢于无包裹EN组,而在包裹的ENM内生物量大于无包裹ENM组。因此,推测在实际生产中,如果使用没有包裹的外源营养料,营养会被快速输出到土壤中而迅速消耗,无法起到有效营养供应的作用,而被包裹的外源营养料能在袋内储存更长的时间,起到“缓释营养”的作用,有助于在羊肚菌2-3月的生产周期内,持续向土壤中的菌丝提供营养。另一方面,添加EN组与无添加组相比,在添加EN后,主培养基内菌丝生长会更旺盛,总体老化速度也减缓,推测是补充新鲜的EN有利于激活菌丝活力,减缓老化速度。

本研究选择滤纸和铝箔纸作为EN的包装材料,与常用的聚丙烯袋进行比较,从生物量来看,不同的包装材料之间没有显著性差异。以滤纸为代表的可降解、无环境污染的包装材料,可以减少采菇后回收外源营养袋的人工工量,并减少环境压力。含铝、银、锌等无机抗菌剂的包装材料可以起到抑菌等效果,在食品包装行业中应用较广（赵亚珠等 2018）。羊肚菌外源营养袋制作中可以尝试使用这类材料,可能有助于降低外源营养袋放置到大田后的袋内污染率。

实际生产中,我们发现外源营养袋采用扁平的装袋方式有利于羊肚菌的菌丝快速吃透养料,充分发挥外源营养的作用,表明外源营养袋的使用形式可能对羊肚菌利用养料有重要的影响。本研究使用模型对相关因素进行模拟,发现随着EN量的增多,主培养基内生物量显著增加;袋划口效果好于刺孔,表明接触面积对营养输出有影响;外源营养袋添加位置、面积、大小等因素对主培养基内生物量没有影响,推测可能模型中EN的量比较少,还没能体现这些因素的影响。主培养基内生物量的增加是否会随着EN的增加而持续增加,添加位置及数量等因素的影响还需要对模型进行完善或者提出新的模型进行研究。

有报道认为外源营养袋添加时间与采收时间呈正相关（代俊杰 2018）,有推荐播种后一周内添加（谭方河 2019）,也有建议播种后7-20d添加（贺国强等 2021）,虽然时间不同,但实质上都是在菌丝萌发后,尽快添加外源营养袋,在具体情况下是否有差异还需要详细研究和比较。本研究使用模型对EN的添加时间进行研究,结果表明在SI阶段添加效果好,其主培养基中生物量高于在SI阶段之前添加EN所形成的生物量,该结果与生产中菌丝萌发后尽快添加的经验基本一致,但也说明不同时间点添加效果有差异,即在实际生产中外源营养袋的使用需要找到最佳时机。

本研究发现,在添加相同量EN时,营养贫瘠的主培养基生物量增幅大于营养丰富的主培养基,这与使用广口瓶法进行分层培养时菌核主要形成于贫瘠营养的土壤层的趋势相似（Volk & Leonard 1989）。基于此推测,在大田栽培中,应降低厢面土壤中的营养物质含量,提高土壤中菌丝对外源营养袋内物质的利用。通过对EN碳氮比的改变,发现不同碳氮比的EN对主培养基生物量的增长有不同效果,与苗人云等（2020）报道合适的外源营养料碳氮比有增产效果、过高或过低都导致产量降低的结果相符,表明外源营养的具体成分及配方对外源营养的效果有影响,行业应该重视并形成相应标准。本研究也对主培养基成分改变如碳氮比等进行了实验,发现主培养基改变后,对菌丝生长有较大影响,导致添加EN的操作不统一和后续分析的困难。

添加EN和不添加EN相比,菌核形成时间推迟1-2d,并且菌核形成位置也由分散于平皿变成集中在ENM周围。已有研究表明活性氧（ROS）对梯棱羊肚菌的菌核形成具有重要调控作用（Liu et al. 2021）,因此推测在添加外源营养后,丰富的营养促进了菌丝的生长,大幅改变了原有的ROS代谢水平,进而影响菌核的形成。

模型中梯棱羊肚菌生物量主要集中在菌核中,故推测菌核形成能力强的梯棱羊肚菌菌株对EN的利用效率较高,反之则低,该结果为菌种的选择提供了一定的判断依据,但实际中菌株对营养袋的利用效率是否和菌核形成能力有关还需要进一步检测。

外源营养袋可以从“外源营养”和“袋”两个角度来理解,两者各有作用,优化和改进外源营养袋技术也应该从两方面入手。本研究建立的外源营养研究模型中,聚丙烯袋包裹的ENM可以向外输出营养,并且得到的结论与实际情况有较好的一致性,通过模型发现了实际栽培中不容易观察到的现象,对外源营养袋机理的研究具有较好的启发,该模型具有一定科学研究意义,也为深入剖析外源营养袋作用机制提供有力帮助。但本模型也存在一些不足,如模型面积较小、EN添加量有限等,可建立其他模型来补充对相关问题的研究结果。