梯棱羊肚菌外源营养作用的影响因素
Influencing factors of exogenous nutrient in Morchella importuna
责任编辑: 王敏
收稿日期: 2021-08-17 接受日期: 2021-09-22
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Corresponding authors:
Received: 2021-08-17 Accepted: 2021-09-22
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作者简介 About authors
董彩虹,中国科学院微生物研究所研究员,博士生导师现任中国菌物学会产业分会常务副秘书长;中国菌物学会蛹虫草分会秘书长,中国中药协会茯苓产业分会副秘书长从事珍稀食药用菌生物学研究,采用正、反向遗传学手段,结合多组学分析,揭示食用菌生殖方式、子实体发育和逆境胁迫机制;基因编辑进行食用菌菌种改良涉及类群包括冬虫夏草、蛹虫草、茯苓、羊肚菌和绣球菌等发表论文80余篇,授权专利8项,参编《中国冬虫夏草》《食用菌栽培学》 , E-mail:dongch@im.ac.cn
外源营养袋的应用是国内羊肚菌大田栽培成功的关键技术之一,但其作用机理和影响因素一直没有得到充分的解析。本研究首先于室内建立一个外源营养模型,确认模型中外源营养模块可以向外输出营养,且被梯棱羊肚菌菌丝利用。通过模型实验发现,外源营养添加到贫瘠培养基时,菌体生物量的增加显著高于营养丰富的培养基;在梯棱羊肚菌生长的不同阶段添加外源营养,菌核形成位置不同,并影响生物量的增加,在菌核起始阶段添加,主培养基的生物量增加最多;外源营养的添加位置、块数等因素在本模型中没有检测到对生物量的影响。外源营养使用聚丙烯袋包裹和不包裹比较发现,包裹组的主培养基内生物量增速和总量低于无包裹组,而外源营养块内趋势相反,但最终两组之间外源营养块与主培养基内生物量总和没有显著差异。使用滤纸和铝箔包裹外源营养时,对生物量的影响和聚丙烯袋材质没有显著差别。外源营养碳氮比20:1时,最有利于主培养基生物量的积累。本研究建立的外源营养研究模型得到的结论与大田栽培有较好的一致性,通过模型发现了实际栽培中不容易观察到的现象,有助于对外源营养袋作用机理进行深入研究。
关键词:
The exogenous nutrient bags (ENB) play an important role in the morel cultivation in China, but the mechanism has not been fully analyzed. In this study, an exogenous nutrition model was first established. The exogenous nutrition module (ENM) in the model could export nutrients and be used by the hyphae of Morchella importuna in the plates, and thereby the effectiveness of the model was confirmed. Adding exogenous nutrition (EN) to infertile medium increase the biomass significantly in comparison with using rich nutrition medium. The sclerotia formed at different locations in the plates when EN was added at different growth stages of M. importuna and the biomass increment was affected. When EN was added at the initial stage of sclerotial formation, the biomass of M. importuna maximally increased. Factors such as the adding location and amount of EN did not affect the biomass observed in this model. ENMs wrapped with and without polypropylene bags did not significantly affected the total biomass, however, the growth rate and total biomass in the wrapped group were lower than those of non-wrapped group in plate, while the opposite trend occurred in ENM. Wrapping EN in filter paper and aluminum foil appeared to be similar in affecting the fungal biomass as compared with wrapping EN in polypropylene bag. C/N ratio of 20:1 was most advantageous for accumulation of biomass. Exogenous nutrition research model established in this study was consistent with the field cultivation of M. importuna, and the phenomenon that was not easy to be observed in cultivation became visible in the model, being helpful for further study of the mechanism of exogenous nutrition.
Keywords:
本文引用格式
刘奇正, 屈珊, 谭方河, 董彩虹.
LIU Qi-Zheng, QU Shan, TAN Fang-He, DONG Cai-Hong.
在羊肚菌的种植过程中,约有20%-50%的工作量与生产成本集中在外源营养袋这一环节(刘伟等 2017;贾乾义等 2020)。李涛等(2018)从羊肚菌生活史、菌核形成的调控模式、营养转运机制等方面,对外源营养袋的作用机制进行了综述,认为外源营养袋的营养配比和摆放时间对羊肚菌生产至关重要,但是缺乏具体实验依据。外源营养袋通常以小麦、棉籽皮、稻壳、木屑、玉米芯、麸皮等为原料(贺新生 2017)。目前,专门对外源营养袋配方的研究报告相对较少,苗人云等(2020)在对六妹羊肚菌Morchella sextelata M. Kuo的研究中,报道其最佳配方(重量比)为麦粒79%、谷壳19%、石灰1%、石膏1%。何俊等(2020)报道适合梯棱羊肚菌Morchella importuna M. Kuo et al.的营养袋优质配方为:小麦58%、阔叶树木屑30%,腐质土10%、石膏1%、石灰1%。然而,大部分栽培从业者在实际应用中并没有对栽培物种进行区分,且使用配方也各不相同(贺新生 2017;贾乾义等 2020)。生产中用料缺乏规范性的指导,给羊肚菌的栽培生产埋下隐患。
外源营养袋作用机制的解析对于羊肚菌栽培技术的优化乃至升级至关重要。田间实验因其生产周期长、实验成本高等,不便于开展对外源营养袋作用机理的深入研究。因此,本研究建立了一种在室内易于实现的外源营养研究模型,拟通过该模型对梯棱羊肚菌利用外源营养的基本特征和利用效果的影响因素进行研究,旨为规范和优化外源营养袋的技术提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株:梯棱羊肚菌菌株CGMCC 5.2196保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 试剂:琼脂购自宝如亿(北京)生物技术有限公司;葡萄糖,硫酸镁,磷酸二氢钾,购自国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨购自安琪酵母股份有限公司。
1.2 外源营养模型
将10mL培养基倒入90mm平皿,凝固后备用,作为主培养基;将定量体积培养基倒入60mm培养皿,凝固后备用,取固定大小作为外源营养模块(exogenous nutrition module,ENM)。
1.3 接种和培养
使用接种钩将菌种块接种到平皿中央,20℃培养箱培养,在设定的时间点将ENM模块放到主培养基上相应位置,正置培养3d后再倒置培养。
1.4 外源营养影响因素研究
1.4.1 主培养基组成:分别以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和1/5 PDA(将马铃薯葡萄糖液体培养基原液稀释5倍后加入1.8%琼脂)作为主培养基,研究主培养基组成对外源营养的作用。
1.4.2 ENM摆放时间:根据实验设置时间点,分别在菌丝生长至1/2平皿、刚长满平皿、菌核起始期、菌核发育期加入ENM。如无说明,为在菌核起始阶段加入ENM。
1.4.3 营养袋包装和划口:按照无包装,聚丙烯袋(划口:3道2cm口,刺孔:10个1mm直径孔),滤纸袋(划口:3道2cm口),铝箔袋(划口:3道2cm口)方式进行包装、备用。
1.4.4 ENM碳氮比:以葡萄糖3%、蛋白胨1%、硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.3%、琼脂1.8%为基础培养基,调节蛋白胨的用量,配制碳氮比分别为10:1、20:1、40:1和60:1的培养基作为ENM,蛋白胨的添加量分别为1%、0.48%、0.24%和0.16%。
1.5 生物量测定
将主培养基或者ENM模块放入锥形瓶中,加入3-5倍体积水后加热充分融化,趁热用1层纱布过滤,将滤布上菌丝体转移到滤纸上,45℃烘干至恒重后称量记录。
1.6 统计分析
所得结果以平均值和标准差表示。利用SPSS 24.0软件对数据进行单因素方差分析(Anova)和LSD检验,P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 外源营养模型的基本特征分析
图1
图1
外源营养研究模型基本特征
A:大田栽培中外源营养袋使用情况;B:外源营养研究模型示意图;C:添加不同量EN的培养平皿;D:添加不同量EN时主培养基生物量;E:添加10mL EN时主培养基中菌核、菌丝干重;F:不同主培养基添加相同量EN时生物量增加. EN:外源营养;ENM:外源营养模块. 不同字母代表显著性差异(One Way Anova,P<0.05). 下同
Fig. 1
Basic characteristics of exogenous nutrition model.
A: Application of exogenous nutrition bags in morel cultivation; B: Schematic diagram of exogenous nutrition model; C: Different volumes of exogenous nutrient (EN) added to the plates; D: Biomass of main medium with different volumes of EN; E: The dry weight of sclerotium and mycelium in the main medium supplemented with 10mL EN; F: Biomass increased in different main medium. EN: Exogenous nutrition; ENM: Exogenous nutrition module. The different letters indicated significant difference (One Way Anova, P<0.05). The same below.
为了研究梯棱羊肚菌对EN的利用与主培养基成分是否有关,采用1/5 PDA和PDA作为主培养基,分别添加20mL PDA作为EN,发现在添加相同EN的情况下,以1/5 PDA为主培养基时生物量的增加量显著高于以PDA为主培养基(图1F),表明主培养基营养贫瘠时,EN能更有力地促进梯棱羊肚菌生长。
2.2 物理因素对外源营养供能影响分析
在大田生产中,外源营养袋何时摆放主要根据经验而定,尚不清楚外源营养摆放时间对栽培的影响。本研究利用上述模型,以1/5 PDA为主培养基进行试验。将EN的添加时间设计为4个时间点,即菌丝生长至约1/2平皿(第3天)、菌丝刚长满平皿(第4天)、菌核起始阶段(SI,第5天)和菌核发育阶段(SD,第6天)。在不同时间点添加EN后,培养效果见图2A,在菌丝没长满阶段添加EN组的菌核分散于整个平皿,菌丝刚长满就添加的菌核有部分围绕ENM形成,SI及SD阶段添加则菌核主要围绕ENM形成。生物量数据显示,在菌丝未长满及刚长满平皿时,添加EN的主培养基生物量小于SI和SD阶段添加,SI阶段添加时生物量最大。
图2
图2
物理因素对外源营养供能影响
A:不同时间添加ENM;B:不同位置添加ENM;C:添加等体积但不同底面积的ENM;D:同量分为不同块数. SI:菌核起始阶段;SD:菌核发育阶段
Fig. 2
The influence of physical factors when adding exogenous nutrient module (ENM).
A: Adding ENM at different growth stages of Morchella importuna; B: Adding ENM at different locations; C: Different base areas of the same volume ENM; D: The same volume ENM is divided into different blocks at the initial stage of sclerotial initiation (SI). SI: Sclerotial initiation; SD: Sclerotial development.
针对ENM的摆放位置以及同量分散为不同块数的条件下,本研究对主培养基内生物量的增加情况进行检测,发现这些因素对主培养基内的生物量没有显著影响(图2B-2D)。
2.3 外源营养包装对供能影响的分析
实际生产中,外源营养主要使用聚丙烯袋进行包装。本研究以聚丙烯材料对ENM进行包装,以不包裹ENM为对照组,分别在添加EN后的3、6、9和12d时,对主培养基和ENM内的生物量进行检测、分析。添加聚丙烯包裹的ENM后,菌核主要在ENM下方形成且形态不规则,ENM无包裹时菌核主要围绕ENM形成(图3A)。主培养基中生物量检测结果显示,添加聚丙烯包裹的ENM时,主培养基内生物量增加显著慢于添加无包裹ENM,且最后增加量也显著低于无包裹ENM(图3B)。但是对ENM中生物量进行检测,发现了不同的趋势,即聚丙烯包裹的ENM内形成的生物量大于无包裹ENM(图3C)。将主培养基及ENM内生物量相加,即为相同物料情况下形成的总生物量,发现无包裹ENM添加时增速快,但最终形成的总生物量两组之间没有显著性差异(图3D)。
图3
图3
添加ENM后不同时间生物量增长情况
A:聚丙烯袋包裹和无包裹ENM添加后不同时间点平皿正反面;B:ENM添加后不同时间点主培养基生物量;C:ENM添加后不同时间点ENM内生物量;D:ENM添加后不同时间点平皿内的总生物量
Fig. 3
Biomass increased in different days after adding ENM.
A: Obverse and reverse of the plates at different time points after unwrapped ENM and wrapped ENM in polypropylene bag were added; B: Biomass in main medium at different time points after adding ENM; C: Biomass of ENM at different time points after adding ENM; D: Total biomass at different time points after adding ENM.
图4
图4
不同材料包裹对ENM的影响
A:聚丙烯袋包裹(划口和刺孔)、滤纸包裹、铝箔包裹ENM时平皿正反面;B:不同材料包裹ENM时主培养基内生物量
Fig. 4
Effects of different wrapping materials on ENM.
A: Obverse and reverse of the plates added with ENM wrapping in polypropylene (scratch and puncture), filter paper and aluminum foil; B: Biomass in main medium when ENM was wrapped with different materials.
2.4 ENM碳氮比的影响
图5
图5
主培养基对不同碳氮比ENM的利用情况
A:添加不同碳氮比的ENM;B:添加不同碳氮比ENM的主培养基生物量
Fig. 5
Utilization of ENM with different C/N ratios.
A: Plates after adding ENM with different C/N ratios; B: Biomass of main medium after adding ENM with different C/N ratios.
3 讨论
本研究在实验室条件下建立外源营养模型,通过模型研究发现,在总物料一致的情况下,EN包裹和不包裹两组之间,虽然最终形成的总生物量没有显著差异,但在主培养基和ENM内的生物量存在相反的趋势。聚丙烯袋包裹EN组的主培养基内生物量增速慢于无包裹EN组,而在包裹的ENM内生物量大于无包裹ENM组。因此,推测在实际生产中,如果使用没有包裹的外源营养料,营养会被快速输出到土壤中而迅速消耗,无法起到有效营养供应的作用,而被包裹的外源营养料能在袋内储存更长的时间,起到“缓释营养”的作用,有助于在羊肚菌2-3月的生产周期内,持续向土壤中的菌丝提供营养。另一方面,添加EN组与无添加组相比,在添加EN后,主培养基内菌丝生长会更旺盛,总体老化速度也减缓,推测是补充新鲜的EN有利于激活菌丝活力,减缓老化速度。
本研究选择滤纸和铝箔纸作为EN的包装材料,与常用的聚丙烯袋进行比较,从生物量来看,不同的包装材料之间没有显著性差异。以滤纸为代表的可降解、无环境污染的包装材料,可以减少采菇后回收外源营养袋的人工工量,并减少环境压力。含铝、银、锌等无机抗菌剂的包装材料可以起到抑菌等效果,在食品包装行业中应用较广(赵亚珠等 2018)。羊肚菌外源营养袋制作中可以尝试使用这类材料,可能有助于降低外源营养袋放置到大田后的袋内污染率。
实际生产中,我们发现外源营养袋采用扁平的装袋方式有利于羊肚菌的菌丝快速吃透养料,充分发挥外源营养的作用,表明外源营养袋的使用形式可能对羊肚菌利用养料有重要的影响。本研究使用模型对相关因素进行模拟,发现随着EN量的增多,主培养基内生物量显著增加;袋划口效果好于刺孔,表明接触面积对营养输出有影响;外源营养袋添加位置、面积、大小等因素对主培养基内生物量没有影响,推测可能模型中EN的量比较少,还没能体现这些因素的影响。主培养基内生物量的增加是否会随着EN的增加而持续增加,添加位置及数量等因素的影响还需要对模型进行完善或者提出新的模型进行研究。
本研究发现,在添加相同量EN时,营养贫瘠的主培养基生物量增幅大于营养丰富的主培养基,这与使用广口瓶法进行分层培养时菌核主要形成于贫瘠营养的土壤层的趋势相似(Volk & Leonard 1989)。基于此推测,在大田栽培中,应降低厢面土壤中的营养物质含量,提高土壤中菌丝对外源营养袋内物质的利用。通过对EN碳氮比的改变,发现不同碳氮比的EN对主培养基生物量的增长有不同效果,与苗人云等(2020)报道合适的外源营养料碳氮比有增产效果、过高或过低都导致产量降低的结果相符,表明外源营养的具体成分及配方对外源营养的效果有影响,行业应该重视并形成相应标准。本研究也对主培养基成分改变如碳氮比等进行了实验,发现主培养基改变后,对菌丝生长有较大影响,导致添加EN的操作不统一和后续分析的困难。
添加EN和不添加EN相比,菌核形成时间推迟1-2d,并且菌核形成位置也由分散于平皿变成集中在ENM周围。已有研究表明活性氧(ROS)对梯棱羊肚菌的菌核形成具有重要调控作用(Liu et al. 2021),因此推测在添加外源营养后,丰富的营养促进了菌丝的生长,大幅改变了原有的ROS代谢水平,进而影响菌核的形成。
模型中梯棱羊肚菌生物量主要集中在菌核中,故推测菌核形成能力强的梯棱羊肚菌菌株对EN的利用效率较高,反之则低,该结果为菌种的选择提供了一定的判断依据,但实际中菌株对营养袋的利用效率是否和菌核形成能力有关还需要进一步检测。
外源营养袋可以从“外源营养”和“袋”两个角度来理解,两者各有作用,优化和改进外源营养袋技术也应该从两方面入手。本研究建立的外源营养研究模型中,聚丙烯袋包裹的ENM可以向外输出营养,并且得到的结论与实际情况有较好的一致性,通过模型发现了实际栽培中不容易观察到的现象,对外源营养袋机理的研究具有较好的启发,该模型具有一定科学研究意义,也为深入剖析外源营养袋作用机制提供有力帮助。但本模型也存在一些不足,如模型面积较小、EN添加量有限等,可建立其他模型来补充对相关问题的研究结果。
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