真菌免疫调节蛋白基因LZ-8过表达载体的构建及转化灵芝原生质体的研究

孙墨可; 张曼; 田娟; 李晓薇; 李海燕; 李玉

doi:10.13346/j.mycosystema.170128

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菌物学报 ›› 2017, Vol. 36 ›› Issue (12) : 1625-1631. DOI: 10.13346/j.mycosystema.170128 CSTR: 32115.14.j.mycosystema.170128

真菌免疫调节蛋白基因LZ-8过表达载体的构建及转化灵芝原生质体的研究

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Construction of an overexpression vector containing LZ-8 gene and transformation of Ganoderma lingzhi protoplasts

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摘要

灵芝Ganoderma lingzhi是我国著名的药用真菌。但是,作为一种营养和保健价值都非常高的大型担子菌,灵芝还缺乏完善的转基因方法和安全转基因体系。本研究建立了免疫调节蛋白基因的过表达系统,并利用真菌特异性启动子GPD、终止子NOS和目的基因LZ-8构建真菌特异性双T-DNA表达载体 pSB130NG-LZ8;利用溶壁酶提取灵芝原生质体,并用FDA染色法检测灵芝原生质体活性,原生质体成活率约为80%。通过PEG转化法对灵芝原生质体成功进行了转化,转化得到的原生质体在带有潮霉素抗性平板上长出,转化率为3-4/μg pSB130NG-LZ8+10⁷个原生质体。转化子通过PCR检测和荧光定量PCR检测,获得LZ-8在灵芝中的过表达。

Abstract

Ganoderma lingzhi is a famous medicinal fungus in China. However, as one of the basidiomycetes with high nutritional and biological value, G. lingzhi still lacks a perfect method for transgenesis and a safe transgenic system. In this study, an overexpression system for regulating immune proteins was established, and a fungus-specific double-stranded T-DNA expression vector pSB130NG-LZ8 was constructed using fungus-specific promoter GPD, terminator NOS and target gene LZ-8. Protoplasts were isolated from G. lingzhi with lywallzymes, and protoplast activity of G. lingzhi was determined by FDA staining. Survival rate of protoplasts was about 80%. Protoplasts of G. lingzhi were successfully transformed by PEG-mediated transformation, and the transformed protoplasts grew on the plate with hygromycin resistance. Transformation rate was about 3-4/μg pSB130NG-LZ8 + 10⁷ protoplasts. Transformants were confirmed to be overexpressed in G. lingzhi by PCR and fluorescent quantitative PCR.

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孙墨可, 张曼, 田娟, 李晓薇, 李海燕, 李玉. 真菌免疫调节蛋白基因LZ-8过表达载体的构建及转化灵芝原生质体的研究[J]. 菌物学报, 2017, 36(12): 1625-1631 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.170128

SUN Mo-Ke, ZHANG Man, TIAN Juan, LI Xiao-Wei, LI Hai-Yan, LI Yu. Construction of an overexpression vector containing LZ-8 gene and transformation of Ganoderma lingzhi protoplasts[J]. Mycosystema, 2017, 36(12): 1625-1631 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.170128

灵芝Ganoderma lingzhi是我国著名的食药用真菌（Cao et al. 2012;戴玉成等2013）。但是,作为一种具有较高营养价值和保健功能的大型真菌,还欠缺安全高效的转基因体系。真菌免疫调节蛋白基因LZ-8是Kino et al.（1989）从灵芝的菌丝体提取到的,研究证明了其具有提高免疫力和促进细胞有丝分裂的作用。近年来,科学家对LZ-8的研究越来越深入,证实了真菌免疫调节蛋白基因LZ-8能够有效调节免疫蛋白且具有抗肿瘤的作用（Yeh et al. 2010;Ling et al. 2012;Wu et al. 2015）。因此提高灵芝培养物中免疫调节蛋白的含量,对于提高灵芝的药效和经济效益具有重要的意义。

分子生物学与基因工程的研究中,将目的基因转化到受体细胞得到阳性转化子后,由表达载体中带有的选择标记基因也同样转入受体细胞中,并在转化子中与目的基因进行共表达,这时选择标记基因在植株中不但已经没有了存在的意义,而且给转基因的植株带来了安全隐患。双T-DNA表达载体指将抗性筛选基因及目标外源基因分别插入两个T-DNA区上,然后再将构建好的载体转入受体细胞中,经筛选后获得共表达植株,再经过有性生殖或自交生殖等手段,在其子代植株中发生性状分离后获得含有目的基因却不含选择标记基因的转基因植株（Cotsaftis et al. 2002）。本研究构建了双T-DNA过表达载体pSB130NG-LZ8,并证明免疫调节蛋白基因LZ-8在转化灵芝菌丝中过表达,为日后得到安全高药效性的灵芝菌株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒：灵芝由吉林农业大学菌物研究所保存。大肠杆菌DH5α由吉林农业大学生物反应器保存。质粒pSB130均购自大连TaKaRa公司（图1）。

图1 表达载体pSB130图谱

Fig. 1 Establishment of binary vector pSB130.

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1.1.2 酶和生化试剂：Taq DNA聚合酶、T载体、限制性内切酶、solution I连接酶等均购自大连TaKaRa公司。PCR引物合成及序列测定由金唯智有限公司完成。其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 培养基和培养条件：灵芝菌丝在PDA液体培养基中,培养条件为120r/min,28℃培养6d,斜面4℃保存。大肠杆菌DH5α在LB培养基中37℃培养,保存在含有15%甘油的LB培养基中,-80℃保存。

1.1.4 PCR引物：根据已知的基因序列,通过生物信息学分析软件Primier5.0设计人工寡核苷酸扩增引物,引物交由TaKaRa公司合成（表1）。

表1 所用引物及序列

Table 1 Primer sequences used for PCR amplification

引物名称 Primer name	序列 Sequence (5′-3′)
GPD-F	GCTCTAGACGTTCGTGACTCGCAATATC
GPD-R	CGGGATCCTGCGGGTGAAAGAGGAGG
LZ-8-F	TCCTCGAGTACAACTCCGGG
LZ-8-R	CGGGGTACCTGCCTCCTCCTAGTTCCAC
NOS-F	TCCTCGAGTACAACTCCG
NOS-R	CCTGGATCGTGTTTGTCC
HygB-F	ATCGTTATGTTTATCGGCACT
HygB-R	ATGTTGGCGACCTCGTATT

1.2 方法

1.2.1 pSB130过表达载体的构建及鉴定：根据已报道的LZ-8基因的氨基酸序列,找到其中的保守区段,设计了两对引物LZ-8-F和LZ-8-R,以灵芝基因组为模板进行LZ-8基因的扩增,扩增到的目的条带切胶回收,连接T载体并测序。以平菇基因组为模板,克隆了真菌特异性GPD启动子,并测序。由得到测序正确的GPD启动子、目的基因LZ-8和实验室保存的NOS终止子,分别设计引物GPD-F和GPD-R、LZ-8-F和LZ-8-R、NOS-F和NOS-R并引入酶切位点。将PCR扩增得到的产物和双T-DNA表达载体pSB130分别用限制性内切酶酶切后,回收目的片段。回收的目的片段用solution I连接酶连接载体pSB130后,转化大肠杆菌DH5α,经由Kan的抗性筛选、37℃培养过夜,然后再抽提质粒,进行PCR、酶切鉴定,使得GPD启动子、LZ-8目的基因和NOS终止子正向插入到pSB130载体上的酶切位点之间,得到重组质粒pSB130GN-LZ8。提取重组菌液质粒,分别进行双酶切后进行电泳检测并测序确认。

1.2.2 灵芝菌丝体的培养与转化：固体平板培养：采用PDA培养基（马铃薯去皮切碎,煮成汁,4层纱布过滤,20g葡萄糖,1g/L KH₂PO₄,0.5g/L MgCl₂,0.01g/L维生素B1）,取菌种斜面上生长旺盛的灵芝菌丝体约0.5cm大小的菌块,接种于固体平板,置于28℃培养箱中培养7-10d至菌丝体长满整个平皿。液体发酵培养：于150mL 三角瓶中装入50mL液体培养基（2%葡萄糖,0.2% Tryptone,0.4% Yeast Extract,0.048% K₂HPO₄,0.05% KH₂PO₄,0.05% MgSO₄·7H₂O）,接入在平皿上活化的菌丝体,在28℃、150r/min的条件下培养7d。

1.2.3 灵芝原生质体的制备与FDA染色检测活性：对在液体摇瓶中的灵芝菌丝体进行原生质体分离并计数,根据实验前期得到的制备原生质体体系为菌丝菌龄4d,酶解温度28℃,酶解时间2h,稳渗剂甘露醇浓度0.4mol/mL。得到的原生质体通过显微镜观察并用计数板计数。经计数板进行灵芝原生质体计数后,将灵芝原生质体用0.4mol/L甘露醇稀释到10⁷个/mL,以备转化使用。用FDA染色法来观察灵芝原生质体的存活率。FDA用丙酮配制成5mg/mL溶液,每毫升的灵芝原生质体悬浮液加入25μL FDA染色剂,在荧光显微镜中直接观察。

1.2.4 PEG法转化灵芝原生质体：取1×10⁷个灵芝原生质体,悬浮在250mL MYG培养基中,然后加入10-20mg待转化的质粒,再加入0.5mL PEG缓冲液（25% PEG4000、10mmoL/L CaCl₂、10mmoL/L Tris-HCl、pH 7.4）,冰浴20min。然后再加入1mL PEG缓冲液,混匀后室温5min,4 000r/min离心10min沉淀原生质体,最后重新悬浮原生质体于1mL MYG再生培养基中,28℃静置培养5d,涂布含有40mg/mL潮霉素的MYG再生平板。一般7-10d后在抗性平板上长出转化子。

1.2.5 灵芝转化子的PCR鉴定：潮霉素抗性基因HygB的PCR检测：取真空抽干的菌丝体,加液氮研磨成粉末,采用CTAB法抽提灵芝菌丝体DNA。取基因组DNA 20ng,采用HygB-F和HygB-R引物扩增潮霉素抗性基因HygB,扩增程序为：预变性94℃ 5min;94℃ 30s,56℃ 40s,72℃ 60s,72℃延伸10min,共30个循环。

1.2.6 Real time PCR反应检测灵芝转化菌株：RNA的提取：采用RNAiso plus（TaKaRa：Code No. 9108/9109）试剂对待检测样本Total RNA进行提取,使用NanoDrop 2000对RNA浓度和质量进行检测,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量和完整性。

cDNA链的合成：样品反转录采用TaKaRa公司Real Time试剂盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa：Code No. RR047A）,具体操作依据试剂盒说明。将得到的cDNA在-20℃保存。

荧光定量PCR反应：本研究采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex,Taq^TM（Tli RNase H Plus）试剂盒,其定量部分操作均在Mx3000P^TMReal Time仪上进行,其操作系统为Strata gene（Mx3000P）。采用两步法PCR扩增标准程序：预变性94℃ 30s;PCR反应94℃ 5s,62℃ 30s,40个循环。溶解曲线95℃ 1min,62℃ 30s,95℃ 30s。每个样品均有3个生物重复和3个技术重复,且设有3个NTC对照。

荧光定量PCR的数据处理：PCR过程中,Mx3000^TM Real-time PCR扩增仪会自动收集荧光信号,当PCR结束后,系统会自动生成包括Ct值、溶解曲线、扩增曲线等一系列的文本和图表文件,观察溶解曲线,看是否单一峰无杂峰以保证PCR产物的特异性,再观察扩增曲线,其扩增效率是否达到95%。本实验采用的是相对定量PCR法,将Ct值导入到Microsoft Office Excel 200x中,将得到的Ct值带入计算公式2^(-∆∆Ct)进行计算。ΔΔCt=(实验组基因的Ct值-内参基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组内参基因的平均Ct)。最后以处理时间为横坐标,以2^(-∆∆Ct)为纵坐标作图。

2 结果与分析

2.1 pSB130表达载体构建

将LZ-8目的基因、GPD启动子、NOS终止子分别和pSB130表达载体连接后转化大肠杆菌DH5α,37℃过夜培养,挑单菌落进行菌液PCR和酶切验证,鉴定结果为阳性后,送上海生物工程公司测序,利用DNAMAN软件将所测得序列与原始序列比对,确定序列正确。表明LZ-8目的基因、GPD启动子、NOS终止子已经连接到pSB130表达载体上,成功构建了表达载体pSB130GN-LZ8（图2）。

图2 表达载体pSB130NG-LZ8示意图

Fig. 2 The map of expression vector pSB130NG-LZ8.

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2.2 灵芝原生质体的制备与FDA染色检测活性

根据实验前期得到的以菌丝菌龄4d、酶解温度28℃、酶解时间2h、稳渗剂甘露醇浓度0.4mol/mL为制备原生质体得率最高的条件制备原生质体,得到的原生质体通过显微镜观察并用计数板计数。由于荧光素不能通过质膜,能在完整的活细胞中积累起来,因此FDA染色后发黄绿色的原生质体为有活性的,不发黄绿色的原生质体为没有活性的。本实验原生质体经FDA染色后在荧光显微镜下观察,有活性的原生质体发出黄绿色荧光,染色清晰（图3）。通过统计原生质体数量可准确获得原生质体存活率。

图3 FDA染色后荧光显微镜下灵芝原生质体状态（40x）标尺=20μm

Fig. 3 Fluorescence microscope observation of Ganoderma lingzhi protoplasts after staining with FDA (40x). Bar=20μm.

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2.3 灵芝转化子的PCR鉴定

实验前期的潮霉素抗性试验表明,HygB最低抑制灵芝原生质体的浓度为40μg/mL。把得到的5个灵芝转化子转接于含40μg/mL的HygB培养基上进行筛选,菌落能够在抗性平板上继续生长,继代培养3代后,提取灵芝菌落DNA,根据HygB设计的引物进行PCR检测（图4）,645bp处可见清晰的目的条带,与HygB基因片段长度相同。经统计,转化效率约为3-4个转化子/10⁷个原生质体。

图4 转化子的PCR检测 M：DNA分子量标记;1：阳性对照;2-6：再生抗性转化子;7：阴性对照

Fig. 4 PCR identification of transformants. M: DL2000 DNA marker; 1: The plasmid pSB130 as positive control; 2-6: Putative transformants; 7: The non-transformed transformant as negative control.

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**2.4 Real time PCR检测LZ-8基因的表达量**

灵芝转化子中总RNA的提取：提取灵芝转化子菌丝总RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测可见清晰条带,证明RNA提取成功且条带清晰、完整、无降解（图5）。

图5 灵芝转化总RNA的提取 M：DNA 分子量标记;1-5：灵芝RNA

Fig. 5 Ganoderma lingzhi transformants of soybean RNA. M: DL10 000 DNA marker; 1-5: Ganoderma lingzhi RNA.

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2.5 实时荧光定量PCR

将mRNA反转录成cDNA,进行荧光定量PCR分析,可以看到灵芝转化菌株中的LZ-8基因的表达量相对于灵芝野生型中的表达量升高,约为野生型的1.6倍（图6）。

**图6 LZ-8基因在野生型灵芝与转化型灵芝中表达情况**

Fig. 6 Relative expression of LZ-8 in the wild type and transformant of Ganoderma lingzhi.

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3 讨论

自1989年以来,科学家们对LZ-8的研究越来越深入,证实了该蛋白基因调节免疫和抗肿瘤的效果（Yeh et al. 2010;Liang et al. 2012）。灵芝中的LZ-8蛋白基因含量低,科学家们就将它克隆后并在大肠杆菌和毕赤酵母中表达,来获取大量蛋白（Xue et al. 2008;Liang et al. 2009;李奇璋等2010;宋细忠等2011）。但LZ-8基因在灵芝的过表达却未见报道。过表达是指目的基因的全长序列与高活性组成型启动子或组织特异性启动子融合,通过转化,获得该基因产物大量积累的菌株。T-DNA载体是一种可以将2个T-DNA区所连接的不同作用元件共转化至受体细胞,并可以在后代中将2个不同的T-DNA区所连接的作用元件发生性状分离,从而提升转基因作物的安全性。双T-DNA表达载体已经成功应用在玉米、大豆、水稻、菊花等植物中,获得了植物的安全转化体系,但在食用菌中却鲜有报道（Xing et al. 2000;Han et al. 2004;Ishida et al. 2004;丁一新和赵明文2006;孙磊等2008）。本实验将真菌特异性启动子GPD、目的基因LZ-8和NOS终止子分别插入与带有潮霉素抗性基因的不同的T-DNA区域,成功构建了双T-DNA过表达载体pSB130NG-LZ8。利用溶壁酶制备灵芝原生质体,经过FDA染色法进行灵芝原生质体染色以检测得到有活性的原生质体,并通过PEG介导的转化原生质体的方法,将构建好的表达载体pSB130NG-LZ8转入灵芝原生质体中。转化后的原生质体在带有潮霉素的再生培养基中培养,得到的转化子通过PCR检测潮霉素抗性基因HygB得到阳性转化子,证明表达载体pSB130NG-LZ8已经成功转入灵芝的原生质体中,也表明了35S启动子在灵芝的原生质体中能够调控HygB基因的表达。在本研究中,得到灵芝转化子5个,转化率为3-4/μg pSB130NG-LZ8+10⁷个原生质体,略低于李刚等在2004年报道的用PEG介导的转化法将pAN7-1质粒转化灵芝原生质体得的转化率为5-6/μg pAN7-1+10⁷个原生质体,也低于徐飞在2007年用PEG介导的转化法将plasmid DNA质粒转化灵芝原生质体得的效率约为20个/μg plasmid DNA+10⁷个原生质体。估计原生质体的转化率与转化因子及表达载体的种类有关。再由荧光定量PCR检测野生型和转化型菌株的表达量,灵芝转化菌株中的LZ-8基因的表达量相对于灵芝野生型中的表达量升高约为野生型的1.6倍,由此证明调节免疫蛋白基因LZ-8在灵芝中有过表达。本文所建立的灵芝调节免疫蛋白基因LZ-8过表达体系不但可以提高灵芝中的蛋白含量,还可以通过基因工程的方法为灵芝日后转基因安全体系和药效的研究奠定基础。

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吉林省重点科技攻关项目（20150204027NY）

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收稿日期	接受日期	出版日期
2017-06-15	2017-11-14	2017-12-22
发布日期
2017-12-22

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