金针菇Fvpal1基因的RNAi降低PAL酶活及菌丝色素分泌

陆欢, 沈玲, 刘建雨, 尚晓冬, 王瑞娟, 谭琦, 唐桂容

菌物学报 ›› 2025, Vol. 44 ›› Issue (4) : 240258.

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菌物学报 ›› 2025, Vol. 44 ›› Issue (4) : 240258. DOI: 10.13346/j.mycosystema.240258 CSTR: 32115.14.j.mycosystema.240258
研究论文

金针菇Fvpal1基因的RNAi降低PAL酶活及菌丝色素分泌

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RNAi of the Flammulina filiformis Fvpal1 gene reduces PAL enzyme activities and mycelial pigment secretion

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摘要

本研究构建了金针菇Flammulina filiformis苯丙氨酸解氨酶基因1 (F. filiformis PAL gene1，Fvpal1)的RNAi载体，以黄色的单核体菌株0990-⑤为受体，通过遗传转化获得5个基因沉默的单核转化子(RNAi-Fvpal1 1-5)。5个单核转化子再分别与白色的单核体菌株Dan3进行杂交，获得5个基因沉默的双核转化子(ZRNAi-Fvpal1 1-5)。考察并分析了单核转化子和双核转化子在PDA培养基上的菌丝生长速度、菌丝的PAL酶活、菌丝在培养基上的色素分泌及Fvpal1基因表达量情况，以验证Fvpal1基因具有调控金针菇颜色的功能。结果显示，10个转化子的Fvpal1基因表达较野生菌株相比都显著下调(P<0.05)，其中转化子RNAi-Fvpal1 1-5分别下调83.41%、75.92%、79.69%、66.49%和43.22%，转化子ZRNAi-Fvpal1 1-5分别下调80.26%、45.24%、34.09%、84.05%和79.62%；除转化子ZRNAi-Fvpal1 4外的9个转化子的PAL酶活力都显著低于出发菌株(P<0.05)。10个转化子的菌丝在PDA培养基上的色素分泌都比出发菌株浅，双核转化子的菌丝在木屑培养基中的颜色也显著变浅，以及双核转化子的子实体颜色也比出发菌株浅。本研究构建了金针菇Fvpal1基因的RNAi体系，发现该基因对金针菇菌丝和子实体的颜色具有正调控作用，为进一步开展金针菇Fvpal1基因的功能基因研究提供了数据支撑。

Abstract

RNA interference for the phenylalanine deaminase gene 1 of Flammulina filiformis (F. filiformis PAL gene1, Fvpal1) was constructed, and five gene-silenced mononuclear transformants (RNAi-Fvpal1 1-5) were obtained through genetic transformation by using the mononuclear strain 0990-⑤ (yellow) as the receptor. The five transformants were separately crossed with monokaryotic strain Dan3 (white) to obtain five gene-silenced binuclear transformants (ZRNAi-Fvpal1 1-5). The Fvpal1 gene expression and traits of the transformants such as mycelial growth rate in PDA medium, PAL enzyme activity, and mycelial pigment secretion were further investigated to verify that Fvpal1 gene has the function of regulating the color of F. filiformis. The results showed that Fvpal1 gene expression was significantly down-regulated in all 10 transformants as compared with that in wild strain (P<0.05). Mononuclear transformants RNAi-Fvpal1 1-5 were down-regulated respectively by 83.41%, 75.92%, 79.69%, 66.49%, and 43.22%, and binuclear transformants ZRNAi-Fvpal1 1-5 were down-regulated respectively by 80.26%, 45.24%, 34.09%, 84.05%, and 79.62%. All nine transformants except the binuclear transformant ZRNAi-Fvpal1 4 had significantly lower PAL-ase activity than the original strain 0990-⑤ (P<0.05). The mycelial pigment secretion of all the 10 transformants grown on PDA medium was lighter than that of the original strain, and the colour of the binucleate transformants became lighter even more significantly on woodchip medium. The fruiting body color of the binuclear transformants is also lighter than that of the strain 0990-⑤. In this study, the RNAi system of Fvpal1 gene of F. filiformis was constructed, and it was found that this gene had a positive regulatory effect on the color of mycelium and fruiting body of F. filiformis. The results provide preliminary evidence in support of further functional gene research of Fvpal1 of F. filiformis.

关键词

金针菇 / Fvpal1基因 / RNA干扰 / 颜色

Key words

Flammulina filiformis / Fvpal1 gene / RNA interference / colour

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陆欢, 沈玲, 刘建雨, 尚晓冬, 王瑞娟, 谭琦, 唐桂容. 金针菇Fvpal1基因的RNAi降低PAL酶活及菌丝色素分泌[J]. 菌物学报, 2025, 44(4): 240258 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.240258
LU Huan, SHEN Ling, LIU Jianyu, SHANG Xiaodong, WANG Ruijuan, TAN Qi, TANG Guirong. RNAi of the Flammulina filiformis Fvpal1 gene reduces PAL enzyme activities and mycelial pigment secretion[J]. Mycosystema, 2025, 44(4): 240258 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.240258
金针菇Flammulina filiformis (Z.W. Ge, X.B. Liu & Zhu L. Yang) P.M. Wang et al.，又称构菌、冬菇、毛柄金钱菌，隶属蘑菇纲Agaricomycetes、蘑菇目Agaricales、膨瑚菌科Physalacriaceae、冬菇属Flammulina (戴玉成和杨祝良 2018；戴玉成等 2021)。金针菇肉质脆嫩、味道鲜美，不仅具有较高的营养价值，还具有促进智力发育、抗氧化和抗癌等药用价值，尤其深受亚洲地区的消费者喜爱(Ukaegbu et al. 2018；陆欢等 2021；王桂林等 2021；王慧等 2021；Luo et al. 2022)。根据金针菇子实体的颜色可将其分为白色和黄色两类，野生金针菇子实体都是黄色，白色金针菇是在选育过程中产生的突变体。世界上第一株白色金针菇‘信浓2号’是日本Takemaru通过单孢分离，再经反复侧交和杂交而得(Sharma et al. 2021)；我国第一个金针菇主栽品种‘三明1号’ (子实体为黄色)是通过野生金针菇驯化而得。目前，我国金针菇主栽品种是从日本引进的白色金针菇品种(刘询等 2023)。
有学者通过侧交和杂交等方法对金针菇子实体的颜色遗传变化进行了研究，其中黄色为显性，白色为隐性，白色菌株在杂交育种过程中还会影响杂交后代菌株的颜色。但对金针菇子实体的颜色是由一对等位基因控制还是由多对等位基因控制仍众说纷纭。因此，还需研究人员建立更有效的方法对金针菇子实体的颜色遗传进行深入研究(Kong et al. 2004；谢宝贵等 2004；蚁瑞荣等 2007a, 2007b；刘丽娜 2016)。刘丽娜(2016)提取了黄色金针菇中的色素，鉴定其为3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)类黑色素；比较了黄色和白色金针菇的色素合成关键酶活性，发现黄色金针菇的超氧化物歧化酶(SOD)活性明显低于白色，但酪氨酸酶的活性显著高于白色；进一步通过转录组测序和实时荧光定量PCR发现酪氨酸酶基因CL1942 contig2、CL1942 contig3、CL1942 contig4在黄色金针菇中的表达量高于白色金针菇，说明金针菇中的黑色素合成与酪氨酸酶基因的表达密切相关。
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia- lyase, PAL, EC4.3.1.24)常见于植物和真菌中，主要作用是催化L-苯丙氨酸脱氨基生成反式肉桂酸。PAL也是苯丙烷代谢途径的关键引发剂，苯丙烷代谢是植物体内重要的次生代谢途径，可产生各种苯丙素，如类黄酮、异黄酮、香豆素、花青素、木质素和其他酚类化合物(Kong 2015)。此外，有研究发现PAL不仅与植物的果皮颜色有关，还在植物抗逆、抗病中也起着重要作用(李海芬等 2017；Fan et al. 2022；胡梦蝶等 2022；Zhao et al. 2022；Zhang et al. 2023；Augustine et al. 2024)。有关食用菌中PAL的相关研究报道极少，仅在少数食用菌品种中成功克隆并鉴定出PAL基因，对其功能的研究也甚少(Yun et al. 2015；Lin et al. 2018；Hou et al. 2019；王艳 2020；Im et al. 2023)。目前有研究发现糙皮侧耳和灰树花中的PAL基因具有调节环境胁迫响应的作用(Hou et al. 2019；王艳 2020)。Yun et al. (2015)在金针菇中克隆了PAL基因并对其表达特征进行了分析，发现PAL基因在菌丝和不同发育阶段的子实体中均有表达，且在菌柄生长中也发挥了一定的功能。Im et al. (2023)发现与黄色金针菇相比，白色金针菇的Fvpal1基因都缺少了∆GCGCAC这6个碱基，导致第112和113位的2个氨基酸(精氨酸和苏氨酸)缺失；且Fvpal1基因中带有和不带有AGCGCAC缺失的单孢子交配产生的后代显示出非白色子实体，然而带有变异Fvpal1基因的单孢子交配产生的后代只有白色子实体，表明Fvpal1基因在决定金针菇子实体的颜色方面起着重要作用。Fu et al. (2022)分析了黄色金针菇采后贮藏过程中的生化和代谢变化，推测金针菇中黑色素可能是通过苯丙氨酸-酪氨酸-L-多巴-5,6-二羟基吲哚(5,6-dihydroxyindole, DHI)/5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)-黑色素途径合成的，还发现酪氨酸代谢途径和苯丙素类生物合成途径的上调。综上所述，推测Fvpal1基因可能影响PAL在金针菇生长过程中的作用，进而影响了金针菇子实体中黄酮类、多酚类和黑色素等可调控颜色的物质生成。
随着高通量测序技术的高速发展，为挖掘白色与黄色金针菇中具有变异的基因位点或具有差异表达的基因提供了快速可靠的手段，再结合RNA干扰、基因过表达或者基因敲除等基因编辑技术对差异基因的功能进行验证。近年来，利用RNA干扰技术开展金针菇的基因功能研究已经取得了一定的进展(Lyu et al. 2021；Yan et al. 2022)。目前，Fvpal1基因中6个碱基的缺失与否是鉴定金针菇子实体颜色的关键，但该基因的功能及与该基因密不可分的PAL酶活是否与金针菇颜色相关都缺乏更系统、深入的研究。本研究拟通过构建金针菇Fvpal1基因的RNAi体系，以黄色的单核体菌株为出发菌株，通过将RNA-Fvpal1转入出发菌株，再将RNAi转化子与白色的单核体菌株进行杂交，测定单核转化子和双核转化子菌丝的PAL酶活、菌丝培养阶段的颜色、Fvpal1基因表达量情况，以及双核转化子的子实体颜色，来探究金针菇Fvpal1的基因功能，为揭示Fvpal1基因与金针菇菌丝阶段的颜色相关性，以及为后续研究金针菇子实体颜色的遗传机制提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和质粒

试验菌株为金针菇黄色的单核体菌株0990-⑤和白色的单核体菌株Dan3，均由上海市农业科学院食用菌研究所提供；大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌EHA105购于上海唯地生物技术有限公司；载体DPV由本实验室保藏、提供。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶SpeⅠ、MluⅠ、I5高保真酶 (赛默飞世尔科技公司)；Ex Taq Mix、RNA提取、产物纯化试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒、质粒小提试剂盒(上海艾科瑞生物科技有限公司)；T4连接酶试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；ABScript Neo RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；苯丙氨酸解氨酶试剂盒[齐一生物科技(上海)有限公司]。

1.1.3 培养基

LB液体培养基；LB固体培养基；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基；马铃薯葡萄糖(PDB)培养基；诱导培养基(induction media, IM)：1 mL K-Buffer，2 mL M-N solution，0.1 mL CaCl2 (1%)，1 mL FeSO4 (0.01%)，0.25 mL NH4NO3 (20%)，0.5 mL Spore elements，1 mL 丙三醇(50%)，4 mL MES，0.5 mL葡萄糖(2 mol/L)，无菌ddH2O定容至100 mL。使用时加入100 mmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone, AS) 0.2 mL，用NaOH或HCl调节pH为5.6；共培养基(Co-IM)：诱导培养基添加20 g/L琼脂粉，用NaOH或HCl调节pH为5.6；木屑培养基(100 g)：玉米芯40 g、木屑30 g、麸皮26 g、玉米粉3 g、石膏1 g，总含水量65%，pH 6.5。工厂化栽培培养基：培养基干物质构成包括玉米芯38.5%，米糠29.5%，麸皮9.6%，棉籽壳5.4%，大豆皮3.2%，啤酒糟4.8%，甜菜渣3.2%，豆渣3.5%，贝化石1.6%，轻质碳酸钙0.7%，含水量约65%，pH自然。

1.2 目标序列的克隆和Fvpal1基因RNAi表达载体构建

选取Fvpal1基因的一段保守结构域，设计两端带酶切位点的特异引物，以菌株0990-⑤和Dan3的cDNA为模板扩增目标序列(388 bp)，将具有双向启动的RNAi载体DPV用SpeⅠ、MluⅠ进行双酶切，再通过T4连接酶将正确的目标序列连接到DPV酶切的线性化片段上，最后生成含有潮霉素B磷酸转移酶基因(Hyg)修饰的RNA干扰质粒RNAi-Fvpal1。将载体RNAi- Fvpal1转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆，提取质粒。分别以Fl-F/Fl-R为引物进行菌液PCR验证，以SpeⅠ、MluⅠ进行双酶切验证，PCR产物回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。载体构建所需引物见表1。
表1 本研究所用的引物

Table 1 Primers used in this study

引物名称
Primer name		 引物序列
Primer sequence (5ʹ→3ʹ)
Fve-F GG A CTAGTGGAAATGGACCTGCTACACTC
Fve-R CG ACGCGTTGACCAATAGTAGGGTCATCG
Hyg-F GATGTTGGCGACCTCGTATT
Hyg-R TCGTTATGTTTATCGGCACTTT
Fl-F GCAGGTCCGAGGTACTAAAG
Fl-R ATCTCCGGAGGCTGAGATG
Qgpd-F CTCGCTTTCCGTGTCCCTA
Qgpd-R CATGGCAGCCTTGATCTCC
Qfv-F CAAGGCACTAGTGTCTACGGC
Qfv-R CAAGCCTCAGGCATGCTTG
注：下划线中的引物序列为酶切位点
Note: Primer sequences underlined are enzyme cleavage sites.

1.3 Fvpal1基因RNAi载体工程菌制备

采用冻融法将RNAi-Fvpal1质粒导入农杆菌EHA105感受态细胞，并通过菌液PCR检测工程菌株是否携带载体Lgpd和目的基因片段。反应体系(20 μL)：菌液1 μL，正向引物Fl-F (10 mmol/L)和反向引物Fl-R (10 mmol/L)各1 μL，Ex Taq Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，33个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4 金针菇菌丝潮霉素致死浓度筛选实验

取菌株0990-⑤直径约为5 mm的菌块分别接种于含不同潮霉素(Hyg)浓度的PDA固体培养基中，Hyg浓度共设置 0、2、4、6、8、10 mg/L 6个梯度，每个梯度分别设3个重复，20 ℃恒温静置培养15 d，观察菌丝生长形态，确定致死浓度。

1.5 金针菇遗传转化及转化子筛选鉴定

1.5.1 制备金针菇菌丝碎片

(1) 将在PDA培养基上培养7-10 d的金针菇菌丝(带培养基一起，D=90 mm)挑入均质仪中，加入100 mL PDB培养基，间歇打碎30 s。
(2) 取步骤(1)中含有菌丝的液体30 mL接入新的PDB培养基中，20 ℃静置避光培养4 d，培养期间早中晚手动摇菌，正反方向各10 s。将培养好的菌丝再次用均质仪间歇打碎，4 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入诱导培养基(不含AS)至沉淀物中，悬浮待用(含1×107个/mL菌丝碎片)。

1.5.2 农杆菌的活化培养

(1) 在含有20 mg/L利福平(rifampicin, Rif)和50 mg/L卡那霉素(kanamycin, Kan)的LB固体培养基平板上划线接种带有目的载体的农杆菌，于28 ℃培养箱中倒置培养1-2 d。
(2) 挑取单菌落接种于1mL LB液体培养基(含20 mg/L Rif和50 mg/L Kan)，28 ℃、200 r/min培养至OD600=0.5-0.6。
(3) 取步骤(2)培养好的50 μL农杆菌菌液，接种于5 mL PDB培养基(含50 mg/L Kan)，28 ℃、200 r/min培养至OD600=0.5-0.6。
(4) 取步骤(3)中培养好的菌液1 mL，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀重悬于5 mL诱导培养基(添加AS 200 μmol/L)，28 ℃、200 r/min培养至OD600=0.5-0.6。活化的农杆菌要立即用于转化。

1.5.3 农杆菌介导的菌丝碎片转化

(1) 将打碎的金针菇菌丝与农杆菌菌液等体积混匀，超声2 min (35 kHz，160 W)，20 ℃静置30 min后涂布于表面铺有微孔滤膜的共培养基表面(添加AS 200 μmol/L，Hyg 5 mg/L，头孢噻肟钠Cef 400 mg/L)，设10个重复。
(2) 20 ℃避光培养，共培养基(含Hyg 5 mg/L，Cef 600 mg/L，AS 200 μmol/L)表面萌发出菌丝后，向共培养基平板内倒入PDA筛选培养基(含Hyg 7 mg/L，Cef 600 mg/L)直至完全覆盖共培养基内萌发的菌丝，20 ℃避光培养10 d，统计萌发、生长的转化子数。挑取转化子单菌落接种于中间放置没有被农杆菌侵染的菌丝(对照)的PDA培养基(含Hyg 7 mg/L，Cef 600 mg/L)上进行培养，置于20 ℃培养箱中培养，观察菌丝的萌发和生长情况；挑取萌发出菌丝的菌块再次接入复筛培养基上进行培养，最后挑取菌丝接种于不含抗生素的PDA培养基上，继代培养5代。

1.5.4 拟转化子的验证及筛选

通过菌落PCR对拟转化子进行验证，挑取0.1-1.0 μg菌丝于50 μL TE buffer中，于PCR仪中97 ℃热解7 min，获得拟转化子的粗DNA。取2 μL DNA为模板，以Fl-F/Fl-R和Hyg-F/Hyg-R为引物进行PCR扩增，将PCR产物回收后进行测序[生工生物工程(上海)股份公司]，依据测序结果确定是否为转化子。

1.6 转化子和单核体菌株Dan3杂交及PCR验证

将上述确定为转化子的菌株与单核体菌株Dan3进行杂交，杂交菌株通过显微镜进行镜检，若具有锁状联合则杂交成功，无锁状联合则杂交失败。将杂交成功的菌株利用Fl-F/Fl-R和Hyg-F/Hyg-R引物再次进行菌落PCR验证，将PCR产物回收后进行测序[生工生物工程(上海)股份公司]，依据测序结果确定是否为转化子。

1.7 荧光定量PCR检测Fvpal1基因表达情况

以金针菇gpd基因为内参基因，单核转化子以出发菌株0990-⑤的cDNA为对照，双核转化子以出发菌株0990-⑤和Dan3的杂交菌株的cDNA为对照。利用RNA提取试剂盒(Vazyme)提取RNAi-Fvpal1和ZRNAi-Fvpal1的RNA。使用ABclonal的ABScript Neo RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover试剂盒进行两步法RT-qPCR检测。第一步进行逆转录反应合成cDNA，第二步进行qPCR反应，反应体系(20 μL)：2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板cDNA 0.5 μL，Nuclease-free H2O 8.7 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40循环。每个样品设3个复孔，相对表达量计算采用2-ΔΔCT法。用于qRT-PCR的引物序列见表1。

1.8 单核转化子及双核转化子菌丝的生长速度及菌丝形态的观察

取活化后直径为5 mm的单核和双核转化子菌株分别接种至PDA培养基上进行培养，设4个重复。采用十字交叉法测量培养11 d的菌丝平均生长速度，用Origin软件进行显著性 分析。

1.9 PAL酶活测定

刮取1.8中培养13 d的菌丝，利用苯丙氨酸解氨酶试剂盒[齐一生物科技(上海)有限公司]测定菌丝的PAL酶活，用Origin软件进行显著性分析。

1.10 双核转化子在木屑培养基中的生长情况

按木屑培养基配方配制培养料，每袋装550 g湿料，121 ℃高温灭菌4 h，冷却至室温后待用。将1个平板上的菌丝划分为1 cm × 1 cm左右的菌块，全部接入到1个栽培袋的培养基表面，接种后置于20 ℃培养箱中静置培养，待菌丝长满栽培袋后，观察菌丝体的颜色。

1.11 双核转化子的子实体生长情况

在山东德州基地按工厂化栽培条件对双核转化子进行培养和栽培，待菌丝长满栽培瓶移入出菇房后，观察子实体的颜色。

2 结果与分析

2.1 金针菇Fvpal1基因RNAi目标序列获得

以菌株0990-⑤总RNA和菌株Dan3总RNA为模板，通过Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒进行cDNA合成，利用带酶切位点的特异引物Fve-F/Fve-R对获得的cDNA进行扩增，电泳图谱条带清晰，以菌株0990-⑤和菌株Dan3的cDNA为模板的扩增产物均在388 bp处出现明显条带，且扩增产物大小与预期一致(图1)。将扩增产物的测序结果与NCBI上的目标序列进行比对(图2)，菌株0990-⑤的cDNA扩增序列从起始密码子开始的第345位碱基由A突变为了G，但所编码的氨基酸仍是谷氨酰胺，属同义突变，不影响后续实验。但菌株Dan3 的cDNA扩增序列比原序列缺少6个碱基(ΔGCGCAC)，这与Im et al. (2023)的研究结果一致。将序列比对正确的产物纯化后用于下一步试验。
图1 金针菇RNAi目标序列PCR产物 1, 2：单核菌株0990-⑤扩增RNAi目标序列；3, 4：单核菌株Dan3扩增RNAi目标序列

Fig. 1 RNAi target sequence PCR product of Flammulina filiformis. M: DL 2 000 DNA marker; 1, 2: The amplified RNAi target sequence of strain 0900-⑤; 3, 4: The amplified RNAi target sequence of strain Dan3.

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图2 RNAi目标序列测序结果比对

Fig. 2 Comparison of sequencing results of RNAi target sequence.

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2.2 RNAi重组表达载体PCR鉴定及测序验证

将SpeⅠ和MluⅠ双酶切位点引入RNAi目标序列中，与双酶切后的DPV线性化载体连接构成重组表达载体RNAi-Fvpal1 (图3A)。大肠杆菌菌液PCR检测见图3B，引物FlHh-F/Fl-R扩增条带大小为520 bp (由153 bp的Lgpd和327 bp的RNAi目标序列组成)，符合重组后序列预期长度。
图3 RNAi载体RNAi-Fvpal1的构建及鉴定 A：RNAi-Fvpal1表达载体结构图. B：大肠杆菌菌液PCR凝胶电泳结果. C：RNAi-Fvpal1酶切凝胶电泳结果；M：DL 15 000 DNA marker；1：RNAi-Fvpal1质粒；2：SpeⅠ单酶切RNAi-Fvpal1条带；3：MluⅠ单酶切RNAi-Fvpal1条带；4：SpeⅠ和MluⅠ双酶切RNAi-Fvpal1条带

Fig. 3 Construction and verification of the RNA interference RNAi-Fvpal1. A: RNAi-Fvpal1 plasmid structure map; B: PCR gel electrophoresis of Escherichia coli liquid; C: Gel electrophoresis of RNAi-Fvpal1 double enzyme digestion, M: DL 15 000 DNA marker, 1: RNAi-Fvpal1 plasmid, 2: SpeⅠmono-digested RNAi-Fvpal1 bands, 3 : MluⅠmono-digested RNAi-Fvpal1 bands, 4: SpeⅠand MluⅠdouble-digested RNAi-Fvpal1 bands.

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选用SpeⅠ和MluⅠ两处酶切位点对RNAi- Fvpal1进行单酶切和双酶切鉴定，载体上的RNAi目标序列片段可被完整切除，单酶切后得到长度约12 000 bp的线性化载体的单一条带；双酶切后于388 bp和10 000 bp处都得到了一条清晰的条带(图3C)，其中388 bp处条带长度与RNAi目标序列基本一致，10 000 bp处则可以定为反应后具有双黏性末端的RNAi-Fvpal1载体，说明酶切后成功构建了含有Hyg修饰的RNAi- Fvpal1质粒。随机挑选6个RNAi-Fvpal1农杆菌工程菌株单菌落进行PCR扩增，通过引物Fl-F/Fl-R扩增出520 bp的片段，说明载体已经成功转化农杆菌菌株(图4)。
图4 农杆菌工程菌菌液PCR凝胶电泳图 M：DL 2 000 DNA marker；1-6：RNAi-Fvpal1转化农杆菌工程菌株；7：ddH2O；8：RNAi-Fvpal1质粒

Fig. 4 PCR gel electrophoresis of Agrobacterium engineering bacteria. M: DL 2 000 DNA marker; 1-6: Agrobacterium strains transformed with RNAi-Fvpal1; 7: ddH2O; 8: RNAi-Fvpal1 plasmid.

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2.3 金针菇菌丝潮霉素致死浓度筛选结果

金针菇的菌丝对潮霉素非常敏感，在不含有潮霉素的PDA 培养基上，金针菇菌丝正常生长，在含有潮霉素的PDA 培养基上，金针菇菌丝不萌发或生长极其缓慢。当培养基中潮霉素浓度为4 mg/L时，金针菇菌丝的生长速度较同时期在正常培养基中培养的菌丝相比生长速度缓慢，菌丝生长明显受到抑制。当潮霉素浓度大于6 mg/L时，金针菇菌丝无萌发延伸能力(图5)。
图5 在添加不同浓度潮霉素的PDA培养基上的菌丝生长情况 A、B、C、D、E中潮霉素质量浓度分别为0、2、4、6、8 mg/L

Fig. 5 Mycelial growth of Flammulina filiformis on PDA medium with different concentration of hygromycin. The mass concentration of hygromycin from A to E is 0, 2, 4, 6, 8 mg/L, respectively.

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根据筛选结果，本研究选择在PDA培养基上添加浓度为5 mg/L的潮霉素用于初步筛选转化子的抗性，在PDA培养基上添加浓度为7 mg/L的潮霉素用于转化子的复筛。

2.4 转化子筛选及PCR验证

在共培养基上再覆盖一层PDA培养基作为筛选培养基，菌丝萌发情况见图6A。分别将萌发的菌丝接种到复筛培养基上进行培养，得到10个RNAi-Fvpal1拟转子(图6B)。10个拟转化子在PDA培养基上进行传代培养，对传代至第5次的菌丝进行PCR扩增，扩增结果见图7。根据PCR产物测序结果最终获得5个单核转化子，依次命名为RNAi-Fvpal1 1、RNAi-Fvpal1 2、RNAi-Fvpal1 3、RNAi-Fvpal1 4、RNAi-Fvpal1 5。
图6 初筛和复筛拟转化子菌丝生长情况

Fig. 6 Mycelial growth of RNAi transformants in primary and secondary screening.

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图7 拟转化子特异引物PCR A：潮霉素基因PCR鉴定结果；M：DL 2000 DNA marker；1-10：拟转化子；11：原始菌株0990-⑤；12：ddH2O；13：RNAi-Fvpal1质粒；B：RNAi-Fvpal1的特异序列PCR鉴定结果；M：DL 2000 DNA marker；1-10：拟转化子；11：原始菌株0990-⑤；12：ddH2O；13：RNAi-Fvpal1质粒

Fig. 7 PCR for specific primers of RNAi transformants. A: Identification results of RNAi-Fvpal1, M: DL 2 000 DNA marker, 1-10: RNAi-Fvpal1 transformants, 11: The original strain 0990-⑤, 12: ddH2O, 13: RNAi-Fvpal1 plasmid; B: PCR identification results of hydomycin gene, M: DL 2 000 DNA marker, 1-10: RNAi-Fvpal1 transformants, 11: The original strain 0990-⑤, 12: ddH2O, 13: RNAi-Fvpal1 plasmid.

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2.5 转化子和白色的单核体菌株杂交及PCR验证结果

分别将单核菌株0990-⑤、RNAi-Fvpal1 1-5与单核菌株Dan3进行杂交，6个杂交菌株镜检后发现均有锁状联合(图8)，说明所有菌株全部杂交成功，将RNAi-Fvpal1 1-5与单核菌株Dan3的杂交菌株分别命名为ZRNAi-Fvpal1 1、ZRNAi- Fvpal1 2、ZRNAi-Fvpal1 3、ZRNAi-Fvpal1 4、ZRNAi-Fvpal1 5。对6个杂交菌株进行菌落PCR扩增，扩增产物电泳结果见图9。
图8 菌株0990-⑤及RNAi-Fvpal1 1-5与菌株Dan3杂交菌株锁状联合图 A：0990-⑤和Dan3杂交菌株的锁状联合；B：RNAi-Fvpal1 1和Dan3杂交菌株的锁状联合；C：RNAi-Fvpal1 2和Dan3杂交菌株的锁状联合；D：RNAi-Fvpal1 3和Dan3杂交菌株的锁状联合；E：RNAi-Fvpal1 4和Dan3杂交菌株的锁状联合；F：RNAi-Fvpal1 5和Dan3杂交菌株的锁状联合

Fig. 8 Clamp connection of mycelia (indicated with circles) of 0900-⑤ and RNAi-Fvpal1 1-5 hybridized with Dan3. A: 0900-⑤ hybridized with Dan3; B: RNAi-Fvpal1 1 hybridized with Dan3; C: RNAi-Fvpal1 2 hybridized with Dan3; D: RNAi-Fvpal1 3 hybridized with Dan3; E: RNAi-Fvpal1 4 hybridized with Dan3; F: RNAi-Fvpal1 5 hybridized with Dan3.

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图9 杂交菌株特异引物PCR A：杂交菌株RNAi-Fvpal1特异序列的PCR鉴定结果，M：DL 2 000 DNA marker；1-5：ZRNAi-Fvpal1拟转化子；6：0990-⑤×Dan3杂交菌株；7：RNAi-Fvpal1质粒；8：ddH2O；B：杂交菌株潮霉素基因的PCR鉴定结果，M：DL 2 000 DNA marker；1-5：ZRNAi-Fvpal1拟转化子；6：0990-⑤×Dan3原始菌株；7：RNAi-Fvpal1质粒；8：ddH2O

Fig. 9 Hybrid strain specific primer PCR. A: PCR identification results of the specific sequences of the hybrid strain RNAi-Fvpal1, M: DL 2000 DNA marker, 1-5: ZRNAi-Fvpal1 transformants, 6: The original strain 0990-⑤×Dan3, 7: RNAi-Fvpal1 plasmid, 8: ddH2O. B: PCR identification results of hydomycin gene, M: DL 2000 DNA marker, 1-5: ZRNAi-Fvpal1 transformants, 6: The original strain 0990-⑤×Dan3, 7: RNAi-Fvpal1 plasmid, 8: ddH2O.

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2.6 Fvpal1基因表达情况

收集培养13 d的杂交菌株的菌丝，利用试剂盒提取RNA后反转录成cDNA。qPCR结果显示，与出发菌株0990-⑤相比，单核转化子RNAi-Fvpal1 1-5中的Fvpal1基因表达量分别下调了83.41%、75.92%、79.69%、66.49%和43.22% (图10A)。与杂交菌株0990-⑤×Dan3相比，在双核转化子ZRNAi-Fvpal1 1-5中的Fvpal1基因表达量分别下调了80.26%、45.24%、34.09%、84.05%和79.62% (图10B)。
图10 Fvpal1在单核转化子和双核转化子中的表达水平 A：Fvpal1在对照菌株0990-⑤和单核转化子RNAi-Fvpal1 1-5的表达量；B：Fvpal1在0990-⑤×Dan3 and binuclear transformants ZRNAi-Fvpal1 1-5的表达量. 标有不同字母表示菌株间存在显著差异(P<0.05)，标有相同字母表示菌株间不存在显著差异(P>0.05)，下同

Fig. 10 Expression level of Fvpal1 gene. A: The expression level of Fvpal1 gene in 0990-⑤ and mononuclear transformants RNAi-Fvpal1 1-5; B: The expression level of Fvpal1 gene in 0990-⑤×Dan3 and binuclear transformants ZRNAi-Fvpal1 1-5. Labeling with different letters indicates significant differences between strains (P<0.05), while labeling with the same letter indicates no significant differences between strains (P>0.05). The same below.

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2.7 菌落形态观察及菌丝生长速度测定结果

与出发菌株0990-⑤相比，单核转化子RNAi- Fvpal1 1-5在PDA培养基上的菌丝表现为气生菌丝更浓密，边缘更整齐、长势更快(图11A)，其中转化子RNAi-Fvpal1 1、RNAi-Fvpal1 2和RNAi-Fvpal1 3的菌丝生长速度显著偏快，RNAi-Fvpal1 4的菌丝生长速度显著偏慢(图12A)。菌株0990-⑤的菌丝边缘可分泌出深褐色物质，5个单核RNAi转化子菌丝边缘分泌出的物质颜色较出发菌株0990-⑤的浅(图11B)。可能与Fvpal1基因对金针菇菌丝的生长具有负调控作用，而对菌丝周边褐色物质形成具有正调控作用相关。
图11 菌落形态观察结果(培养13 d) A：对照菌株和单核转化子在PDA培养基上的生长情况(正面)；B：对照菌株和单核转化子在PDA培养基上的生长情况(背面)，从左到右依次为：0990-⑤、RNAi-Fvpal1 1、RNAi-Fvpal1 2、RNAi-Fvpal1 3、RNAi-Fvpal1 4、RNAi-Fvpal1 5；C：对照菌株和双核转化子在PDA培养基上的生长情况(正面)；D：对照菌株和双核转化子在PDA培养基上的生长情况(背面)；E：对照菌株和双核转化子菌株在PDA培养基(含7 mg/L Hyg)上的生长情况(正面)，从左到右依次为：0990-⑤×Dan3、ZRNAi-Fvpal1 1、ZRNAi-Fvpal1 2、ZRNAi-Fvpal1 3、ZRNAi-Fvpal1 4、ZRNAi-Fvpal1 5

Fig. 11 Observation of colony morphology (cultured 13 d). A: The growth of control strain and mononuclear transformants in the PDA medium (obverse); B: The growth of control strain and mononuclear transformants in the PDA medium (reverse), from left to right: 0990-⑤, RNAi-Fvpal1 1, RNAi-Fvpal1 2, RNAi-Fvpal1 3, RNAi-Fvpal1 4 and RNAi-Fvpal1 5; C: The growth of control strain and binuclear transformants in the PDA medium (obverse); D: The growth of control strain and binuclear transformants in the PDA medium (reverse); E: The growth of control strain and binuclear transformants in a PDA medium (including 7 mg/L Hyg) (obverse), from left to right: 0990-⑤×Dan3, ZRNAi-Fvpal1 1, ZRNAi-Fvpal1 2, ZRNAi-Fvpal1 3, ZRNAi-Fvpal1 4 and ZRNAi-Fvpal1 5.

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图12 菌丝在PDA培养基中的生长速度 A：对照菌株0990-⑤和单核转化子RNAi-Fvpal1 1-5的菌丝生长速度；B：对照菌株0990-⑤×Dan3和双核转化子ZRNAi-Fvpal1 1-5的菌丝生长速度

Fig. 12 Mycelial growth rate in PDA medium. A: Mycelial growth rate of 0990-⑤ and mononuclear transformants RNAi-Fvpal1 1-5; B: Mycelial growth rate of 0990-⑤×Dan3 and binuclear transformants ZRNAi-Fvpal1 1-5.

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双核转化子菌株在PDA培养基上，5个双核转化子菌株ZRNAi-Fvpal1较对照菌株(0990-⑤×Dan3)相比，菌丝量较为稀疏，尖端菌丝的长势较弱(图11C, 11D)；菌株ZRNAi-Fvpal1 1、ZRNAi-Fvpal1 2和ZRNAi-Fvpal1 3的菌丝生长速度显著快于出发菌株0990-⑤×Dan3 (图12B)。对照菌株(0990-⑤×Dan3)和出发菌株0990-⑤一样，在菌丝尖端周围可分泌出带颜色的物质，但颜色浅于出发菌株0990-⑤，但也符合黄白杂交而减少了带颜色物质产生的遗传规律。与对照菌株(0990-⑤×Dan3)相比，5个双核转化子的菌丝尖端周边分泌出的物质颜色较对照菌株(0990- ⑤×Dan3)更浅。此外，5个双核转化子都能在含7 mg/L Hyg的PDA培养基上生长，说明出发菌株0990-⑤中的Fvpal1基因的干扰效果在杂交菌株中依然发挥作用。

2.8 PAL酶活测定结果

与出发菌株0990-⑤相比，单核转化子RNAi-Fvpal1 1-5菌丝的PAL酶活分别下降了41.58%、13.45%、34.85%、40.55%、14.41% (图13A)。双核转化子ZRNAi-Fvpal1 1-5菌丝的PAL与对照菌株(0990-⑤×Dan3)相比也均有所下降，其中ZRNAi-Fvpal1 1、ZRNAi-Fvpal1 2、ZRNAi-Fvpal1 3、ZRNAi-Fvpal1 5分别显著下降36.05%、21.00%、51.39%、27.70% (图13B)。综上所述，经RNAi后的金针菇中Fvpal1基因影响了菌株的PAL酶活。
图13 菌丝的PAL酶活 A：对照菌株0990-⑤和单核转化子RNAi-Fvpal1 1-5菌丝的PAL酶活；B：对照菌株0990-⑤×Dan3和双核转化子ZRNAi-Fvpal1 1-5菌丝的PAL酶活

Fig. 13 PAL enzyme activity of mycelium. A: PAL enzyme activity of 0990-⑤ and mononuclear transformants RNAi-Fvpal1 1-5; B: PAL enzyme activity of 0990-⑤×Dan3 and binuclear transformants ZRNAi-Fvpal1 1-5.

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2.9 双核转化子在木屑培养基中的生长情况

双核转化子在木屑培养基中培养40 d的生长情况见图14，这6个菌株在栽培袋中菌丝均分泌出了黄褐色物质，对照菌株(0990-⑤×Dan3)菌丝分泌出的黄褐色物质颜色最深，且所占体积最大，说明对出发菌株0990-⑤进行Fvpal1基因的RNAi后再与Dan3杂交，能在出菇前的菌丝培养阶段有效抑制菌丝周围黄褐色物质的生成。
图14 双核转化子在木屑培养基中的生长情况 从左到右依次为0990-⑤×Dan3、ZRNAi-Fvpal1 1、ZRNAi-Fvpal1 2、ZRNAi-Fvpal1 3、ZRNAi-Fvpal1 4和ZRNAi-Fvpal1 5

Fig. 14 Growth of binuclear transformants in sawdust medium. From left to right: 0990-⑤×Dan3, ZRNAi-Fvpal1 1, ZRNAi-Fvpal1 2, ZRNAi-Fvpal1 3, ZRNAi-Fvpal1 4 and ZRNAi-Fvpal1 5.

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2.10 双核转化子在工厂化栽培条件下的子实体情况

双核转化子在同等工厂化栽培条件下，子实体生长情况见图15，出发菌株9900-⑤的双核菌株0990、对照菌株(0990-⑤×Dan3)、杂交菌株(0990-②×Dan3)以及双核转化子ZRNAi-Fvpal1 1和ZRNAi-Fvpal1 2的子实体颜色均为黄色，ZRNAi-Fvpal1 3-5未出菇。其中双核转化子ZRNAi-Fvpal1 1和ZRNAi-Fvpal1 2的子实体颜色浅于对照菌株(0990-⑤×Dan3)，菌株0990颜色最深。说明出发菌株0990-⑤进行Fvpal1基因的RNAi后再与Dan3杂交，双核转化子的子实体颜色与菌丝培养时分泌物颜色的结果一致。
图15 对照菌株和双核转化子在工厂化栽培条件下子实体生长情况 从左到右依次为0990、0990-⑤×Dan3、0990-②×Dan3、ZRNAi-Fvpal1 1和ZRNAi-Fvpal1 2

Fig. 15 The proliferation of fruiting bodies of the reference strain and the binucleate transformant under industrial cultivation conditions. From left to right: 0990, 0990-⑤×Dan3, 0990-②×Dan3, ZRNAi-Fvpal1 1 and ZRNAi-Fvpal1 2.

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3 讨论

在植物中，由苯丙氨酸的碳链通过多分支苯丙类生物合成途径合成的苯丙类化合物在宿主抵御病原体的过程中具有广泛的生物功能，而苯丙氨酸解氨酶基因则是苯丙氨酸代谢途径的关键限速酶(Kong 2015；Zhang et al. 2023；Augustine et al. 2024)。PAL是花青素合成途径的第一个关键酶。在花生中，PAL的表达可能与花生种皮花青素的形成有关，但PAL的表达量与种皮颜色深浅之间的关系尚不明确(Fan et al. 2022)；芒果果皮花色苷含量与PAL的表达密切相关，与红色芒果(贵妃)相比，青色芒果(贵旗)和黄色芒果(京黄)在成熟过程中花色苷产量较低是由于PAL酶在翻译水平上活性降低所致。在芒果中，果实的颜色变化很有可能是花青素代谢途径中PAL基因突变的结果(李海芬等 2017)。
本研究成功获得了出发菌株0990-⑤的RNAi阳性转化子，发现Fvpal1基因与出发菌株0990-⑤的菌丝生长速度和菌丝的PAL酶活相关。当Fvpal1基因被干扰后，单核转化子RNAi-Fvpal1 1、RNAi-Fvpal1 2和RNAi-Fvpal1 3的菌丝生长速度明显变快，经qRT-PCR检测发现转化子的Fvpal1基因显著下调，相应的PAL酶活性也有不同程度的下降。5个单核转化子分别与单核菌株Dan3杂交后获得的双核转化子中，ZRNAi-Fvpal1 1、ZRNAi-Fvpal1 2和ZRNAi-Fvpal1 3的菌丝生长速度也明显变快，所有菌株的qRT-PCR结果显示Fvpal1基因均显著下调，相应的PAL酶活性也均低于对照菌株(0990-⑤×Dan3)。结果表明Fvpal1基因可能对金针菇菌丝的生长速度具有负调控作用，而对深褐色色素的合成具有正调控作用。
本研究发现黄色与白色金针菇菌丝的PAL酶活有显著差异，且Fvpal1基因对金针菇菌丝周围分泌物质和子实体的颜色具有一定的影响，研究结果为金针菇Fvpal1基因与其子实体颜色相关提供了初步证据。后续将继续开展双核转化子和对照菌株(0990-⑤×Dan3)的出菇实验，验证菌株RNAi后对子实体颜色的影响。同时以黄色菌株的另一个单核体0990-②为出发菌株，与白色的单核体Dan3和该菌株另一个核进行配对，以进一步对Fvpal1基因的功能进行验证。因为对Fvpal1基因与子实体颜色的研究不能仅停留在菌丝体阶段，分析双核转化子与对照菌株的子实体菌盖和菌柄颜色的差别也是证明Fvpal1基因与金针菇子实体颜色相关最有力的证据。此外，还需对金针菇Fvpal1基因进行过表达，从正反两面对Fvpal1基因的功能进行研究；还可对该基因进行完全敲除，验证敲除后的金针菇菌丝不分泌黄褐色物质，以及子实体颜色为白色。Sakamoto et al. (2017)提出苯丙氨酸解氨酶(PAL)与酪氨酸酶和漆酶协同参与色素的形成，因此，还需继续挖掘和鉴定与金针菇子实体颜色相关的其他生物合成基因，如酪氨酸酶和漆酶，并构建其他表达差异显著关键酶的RNAi突变体，以期揭示金针菇子实体颜色形成的遗传规律和调控机制。

作者贡献

陆欢：论文撰写；沈玲、刘建雨：数据分析；尚晓冬：论文构思和指导；王瑞娟：论文审核和编辑写作；谭琦：论文指导；唐桂容：数据验证和审核。

利益冲突

作者声明，该研究不存在任何潜在利益冲突的商业或财务关系。

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https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.210036
摘要

Macrofungi, as an important component in forest ecosystems, consist of most members of Basidiomycota and some members of Ascomycota, having important economical value and ecological functions. Extensive field investigations have been carried out in almost whole types of the Chinese forests during the past 30 years, and 112 000 specimens were collected. Based on morphological examination and phylogenetic analyses in combination with ecology and biogeography, 4 250 species belonging to 21 orders in Baidiomycota and Ascomycota were identified, including two new families, four new subfamilies, 69 new genera and 885 new species. Yunnan Province is the richest in macrofungal diversity among provinces or regions in China, and 314 new species were described from this province, accounting for 35% of all the new species described from China by the authors. Our studies have made contributions to deepening the understanding of global diversity of macrofungi. The names of some important Chinese medicinal fungi were revised, the diversity characteristics of Chinese poisonous mushrooms were revealed, and the pathogenetic wood-decaying species were ascertained. These data improved our knowledge on utilization of natural resources and protection of forest health. Based on molecular evidences, the origin of some forest representative fungal genera or species complex were deduced, and their dispersal and speciation were discussed, for the purposes of providing some data for evolutionary study at level of family, order or class of macrofungi henceforth.
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https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.210036
本文引用 [1] 摘要
大型真菌主要为担子菌门的真菌和少数为子囊菌门的真菌,该类真菌具有重要的经济价值和生态功能,主要生长在森林生态系统中。30年来作者对我国几乎所有类型森林生态中的大型真菌进行了系统调查和采集,共采集标本11.2万号。基于对这些材料的形态学及分子系统学研究,并结合生态学和生物地理学特征,共鉴定出中国森林大型真菌4 250种,隶属于担子菌门和子囊菌门的21个目,发现和发表2个新科、4个新亚科、69个新属和885个新种。云南省是我国森林大型真菌最丰富的省份,描述于该省的新种有314种,占作者发表的全部中国新种的35%。这些研究为深入认识全球大型真菌物种多样性提供了中国的贡献,更新了我国重要食药用菌名称,揭示了我国毒蘑菇多样性基本特征,系统论述了我国森林病原菌的物种多样性,为资源利用、森林健康和保护提供了科学依据;论述了森林大型真菌代表性类群在种和属级水平的起源和演化,为今后开展重要类群科级、目级甚至纲级的系统进化关系提供了重要数据。
[33]
胡梦蝶, 李佳伟, 王梅, 刘彬, 马钰聪, 赵雨露, 杨鑫雷, 崔顺立, 侯名语, 蒋晓霞, 穆国俊, 2022. 花生花斑种皮花青素生物合成相关miRNA及其靶基因鉴定与分析. 植物遗传资源学报, 23(1): 226-239
https://doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20210519001
本文引用 [1] 摘要
花生在世界粮油食品中占有重要地位，其种皮颜色有白色、红色、紫色、粉红色及花斑等多种颜色，花斑种皮花生是其独特的成员之一，具有便于区分的优良性状。本研究以花斑种皮花生VG-02为研究材料，结果表明与花斑种皮颜色合成相关差异表达的miRNA富集的代谢途径有苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、异黄酮的生物合成，昼夜节律-植物。miRNA测序结果中共筛选出86个差异表达miRNA，其中20个差异表达的miRNA与花生花斑种皮颜色合成相关。与花生花斑种皮花青素合成相关的20个差异表达miRNA包括miR_8、miR_50、miR_51和miR_239-x,这4个是共同靶向花青素、类花青素和IFS靶基因的miRNA；调控CHS靶基因的miR_398-x，调控4CL靶基因的miR_482，调控F3’H靶基因的miR_266和miR_182以及调控花青素3-O-葡萄糖苷靶基因的miR_5，这是5个靶向花青素生物合成中结构基因的miRNA；miR858-y靶向调控MYB2和MYB3,这是1个靶向花青素生物合成调节基因的miRNA；miR_10、miR_15、miR_61、miR_72、miR_102、miR_116、miR_123、miR_193、miR_256和miR_862-z这10个是靶向CYP450靶基因的miRNA。miRNA测序与转录组联合分析KEGG代谢通路表明类黄酮生物合成是花生种皮花斑形成最直接的代谢途径。本研究对于全面揭示花斑花生种皮花青素合成的分子机制有重要意义。
[34]
李海芬, 邱金梅, 陈小平, 洪彦彬, 梁炫强, 2017. 花生花青素合成相关基因的表达与种皮颜色关系. 中国油料作物学报, 39(5): 600-605
https://doi.org/10.7505/j.issn.1007-9084.2017.05.003
本文引用 [2] 摘要
花生品种种皮颜色与花青素的积累有关，为了探讨花青素合成相关基因表达与种皮颜色的关系，本文采用HPLC和实时荧光定量PCR技术，分析4种不同种皮颜色的花生品种种皮花青素的种类和含量，以及花青素合成相关基因在4个品种5个荚果发育关键时期的差异表达。结果表明：花生种皮的花青素主要由飞燕草色素、矢车菊色素和天竺葵色素等三种色素组成；花生种皮的外观颜色和深浅主要由飞燕草色素和矢车菊色素含量决定，飞燕草色素和矢车菊色素含量越高，种皮颜色越深。花青素合成相关基因主要在种子充实期（开花后约40-50d）上调表达。花生种皮颜色的深浅与查耳酮合成酶基因（CHS）、查尔酮异构酶基因（CHI）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）、类黄酮-3'羟化酶基因（F3'H ）和花色苷合成酶基因（ANS）等基因在种子充实期（开花后约40-50d）高表达显著相关。上述5个基因表达量愈高，种皮颜色愈深。
[35]
刘丽娜, 2016. 金针菇颜色突变型的遗传属性研究. 湖南师范大学硕士论文, 长沙. 1-46
本文引用 [2]
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刘询, 刘天海, 王波, 贾定洪, 彭卫红, 何晓兰, 2023. 金针菇分子生物学和功能基因研究进展. 菌物学报, 42(1): 130-142
https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.220433
本文引用 [1] 摘要
金针菇是重要的食药用菌，具有很高的经济价值。随着金针菇全基因组序列的公布、多组学分析、转基因技术、基因编辑技术的发展，越来越多的研究者开始关注金针菇重要性状(如生长速度、菌柄长度、生物活性物质含量等)相关的分子调控机制以及关键基因的发掘。本文综述了分子生物学技术在金针菇研究中的应用并分析了不同技术的利弊;同时，系统介绍了金针菇菌丝和子实体生长发育、温度应答、生物活性物质代谢、蓝光响应等重要生物学过程中调控基因的最新研究进展，并对未来金针菇分子生物学研究的方向进行了展望，旨在为我国金针菇产业的发展提供有价值的参考。
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陆欢, 王瑞娟, 刘建雨, 宋春艳, 尚晓冬, 2021. 不同品种金针菇的营养成分分析与评价. 食品与机械, 37(6): 69-75, 96
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王慧, 郭东方, 王鑫, 2021. 金针菇的营养保健功能及开发利用现状. 中国食用菌, 40(11): 11-14, 24
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本文引用 [1]
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蚁瑞荣, 曹晖, 潘迎捷, 2007b. 金针菇杂合菌株子实体颜色遗传分析. 食用菌学报, 14(4): 19-21, 91
本文引用 [1]

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上海市农业科学院卓越团队建设计划（沪农科卓[2022]001）
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