RNAi of the Flammulina filiformis Fvpal1 gene reduces PAL enzyme activities and mycelial pigment secretion

LU Huan; SHEN Ling; LIU Jianyu; SHANG Xiaodong; WANG Ruijuan; TAN Qi; TANG Guirong

doi:10.13346/j.mycosystema.240258

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Mycosystema ›› 2025, Vol. 44 ›› Issue (4) : 240258. DOI: 10.13346/j.mycosystema.240258

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RNAi of the Flammulina filiformis Fvpal1 gene reduces PAL enzyme activities and mycelial pigment secretion

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Abstract

RNA interference for the phenylalanine deaminase gene 1 of Flammulina filiformis (F. filiformis PAL gene1, Fvpal1) was constructed, and five gene-silenced mononuclear transformants (RNAi-Fvpal1 1-5) were obtained through genetic transformation by using the mononuclear strain 0990-⑤ (yellow) as the receptor. The five transformants were separately crossed with monokaryotic strain Dan3 (white) to obtain five gene-silenced binuclear transformants (ZRNAi-Fvpal1 1-5). The Fvpal1 gene expression and traits of the transformants such as mycelial growth rate in PDA medium, PAL enzyme activity, and mycelial pigment secretion were further investigated to verify that Fvpal1 gene has the function of regulating the color of F. filiformis. The results showed that Fvpal1 gene expression was significantly down-regulated in all 10 transformants as compared with that in wild strain (P<0.05). Mononuclear transformants RNAi-Fvpal1 1-5 were down-regulated respectively by 83.41%, 75.92%, 79.69%, 66.49%, and 43.22%, and binuclear transformants ZRNAi-Fvpal1 1-5 were down-regulated respectively by 80.26%, 45.24%, 34.09%, 84.05%, and 79.62%. All nine transformants except the binuclear transformant ZRNAi-Fvpal1 4 had significantly lower PAL-ase activity than the original strain 0990-⑤ (P<0.05). The mycelial pigment secretion of all the 10 transformants grown on PDA medium was lighter than that of the original strain, and the colour of the binucleate transformants became lighter even more significantly on woodchip medium. The fruiting body color of the binuclear transformants is also lighter than that of the strain 0990-⑤. In this study, the RNAi system of Fvpal1 gene of F. filiformis was constructed, and it was found that this gene had a positive regulatory effect on the color of mycelium and fruiting body of F. filiformis. The results provide preliminary evidence in support of further functional gene research of Fvpal1 of F. filiformis.

Key words

Flammulina filiformis / Fvpal1 gene / RNA interference / colour

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LU Huan, SHEN Ling, LIU Jianyu, SHANG Xiaodong, WANG Ruijuan, TAN Qi, TANG Guirong. RNAi of the Flammulina filiformis Fvpal1 gene reduces PAL enzyme activities and mycelial pigment secretion[J]. Mycosystema, 2025, 44(4): 240258 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.240258

蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Fr.，又称“北虫草”，是一种独特而珍贵的食药用真菌，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、保肝和免疫调节等多种药理活性(戴玉成和杨祝良2008；Wu et al. 2019；Ren et al. 2020)，并已被我国原卫生部批准为新资源食品，具有重要的研究开发价值。近年来，蛹虫草的抗氧化活性已得到国内外学者的广泛验证和认可。研究表明，蛹虫草具有多种自由基清除能力(Yu et al. 2007)，并且能够有效降低细胞内活性氧水平(叶章正等2012)。同时，蛹虫草及相关产物还能够提升抗氧化物酶活性，降低丙二醛(MDA)含量，起到抵御氧化应激损伤的作用(Liu et al. 2016；Zhang et al. 2019)。因此，蛹虫草已经成为天然抗氧化功效产物筛选的重要真菌资源，在食品、医药以及化妆品领域均受到广泛关注，并表现出较好的潜力。

随着社会整体生活水平的提高，皮肤防护问题逐渐成为人们关注的焦点。当皮肤受到环境污染、紫外线等不利刺激时，会产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)从而使细胞内源性抗氧化系统失衡，引起氧化应激，进而诱发炎症、皮肤肿瘤和异常衰老等皮肤问题(Kang et al. 2014；Kammeyer & Luiten 2015；Kim et al. 2016)。因此，及时清除自由基，提高机体抗氧化能力成为预防和治疗细胞氧化应激的理想策略。近年来，天然提取物对皮肤氧化损伤的保护作用越来越受到研究人员的关注。Abate et al. (2020)研究发现灵芝提取物可诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT)增殖，并增加周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK6的表达，保护HaCaT细胞免受H₂O₂诱导细胞毒性。丁亚男等(2024)通过HaCaT细胞氧化损伤模型研究油橄榄叶提取物抗氧化活性，发现其能够有效清除细胞内自由基，明显改善HaCaT细胞氧化应激状态。目前，有关蛹虫草活性的研究多集中于体外抗氧化和肝损伤保护等方面，对蛹虫草保护皮肤细胞氧化损伤作用的研究较少。

因此，本研究以蛹虫草水提物为研究对象，表征其主要活性成分，并以H₂O₂诱导氧化损伤的HaCaT细胞为模型，探究蛹虫草水提物抗氧化能力以及对皮肤细胞氧化损伤的保护作用，为其在功效化妆品方向的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验材料

蛹虫草子实体，购自沈阳聚鑫生物有限公司，栽培基质为大米，并经中国海洋大学江晓路教授鉴定为蛹虫草。子实体60 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛，阴凉处密封保存备用。

人永生化角质形成细胞(HaCaT)，购自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基、血清、胰酶，普诺赛生命科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，Sigma公司；水杨酸、无水乙醇、甲醇、硫酸亚铁、30%过氧化氢均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；蛋白质定量(BCA)测试盒、活性氧(ROS)测试盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒，南京建成生物科技公司。

1.1.3 主要仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)；TECAN Infinite E Plex酶标仪(上海帝肯贸易有限公司)；HF90型二氧化碳培养箱(力康仪器有限公司)；HCB-900V型超净台(青岛海尔生物医疗有限公司)；DXS-2型普通倒置显微镜(上海缔伦光学仪器有限公司)。

1.2 蛹虫草水提物的制备

称取一定量的蛹虫草粉末，按料液比1:10 (质量体积比)于沸水中浸提40 min后，4 000 r/min离心10 min取上清，重复两次，合并上清液，浓缩、冻干得蛹虫草水提物(Cordyceps militaris aqueous extract, CME)。

1.3 CME主要活性成分分析

1.3.1 多糖含量及单糖组成

多糖的提取：精密称取CME粉末1.0 g，用水溶解并定容至50 mL容量瓶中，向样品溶液中加入3倍体积95%乙醇，4 ℃静置12 h后，离心弃去上清，沉淀经除蛋白、60 ℃烘干即得蛹虫草多糖。

多糖含量测定：将得到的多糖样品加水定容到100 mL，根据GB/T 15672-2009以苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖浓度为横坐标，波长490 nm下吸光值为纵坐标，标准曲线回归方程为：y=15.909x+0.041 2，R²=0.999。CME中多糖含量按照公式(1)计算：

多糖含量 (%) = 糖含量 / (10 \cdot m g / m L) \times 100 .

(1)

单糖组分分析：根据宗雯雯等(2018)的方法，精密称取多糖粉末10 mg，经三氟乙酸水解和PMP衍生后，取上清以0.22 µm滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱，流动相为乙腈-50 mmol/L磷酸盐缓冲液(17:83，体积比) (pH 6.9)，流速1.0 mL/min，检测波长245 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

1.3.2 核苷类成分

参照朱丽娜等(2018)的方法，精密称取CME粉末0.5 g，加25 mL蒸馏水振荡15 min使粉末完全浸透，超声提取20 min。离心取上清，以0.22 µm滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax Extend-C18柱、流动相为甲醇-水梯度洗脱，流速0.5 mL/min，检测波长260 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

1.3.3 其他活性成分

总多酚的测定参照李剑梅等(2023)的Folin- Ciocalteu法；类胡萝卜素的测定参照周翔宇等(2021)的方法。

1.4 CME抗氧化活性研究

参照吴梦思等(2024)的方法检测CME对DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果，参照Meng et al. (2015)的方法检测CME对·OH自由基的清除效果。清除率按照公式(2)计算：

清除率 (%) = [1 - (T - T_{0}) / C] \times 100

(2)

T表示样品管的吸光值；T₀表示样品本底的吸光值；C表示以蒸馏水代替样品溶液测得空白对照管的吸光值。

1.5 CME对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

1.5.1 细胞培养

用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基培养HaCaT细胞，并置于37 ℃、5% CO₂培养箱，备用。

1.5.2 CME对HaCaT细胞的毒性

以MTT比色法(金银萍等 2015)检测细胞活力。取对数生长期的细胞按5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，接种量100 μL，待细胞培养至融合度70%-80%后，加入不同浓度(0、10、25、50、100、200、400、600、1 000 μg/mL)的CME处理HaCaT细胞24 h。每孔加入20 μL MTT溶液，于培养箱中孵育4 h后弃液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振荡10 min充分溶解后，用酶标仪测490 nm波长下吸光值，并以空白孔调零，每个浓度设6个平行。

1.5.3 HaCaT氧化损伤模型建立

选择对数生长期的细胞按5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，接种量100 μL，待细胞培养至融合度70%-80%后，加入含不同浓度(0、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L) H₂O₂溶液的DMEM培养基处理HaCaT细胞4 h，按1.5.2的方法测定细胞活性。

1.5.4 CME对H₂O₂损伤HaCaT细胞的影响

取对数生长期的细胞按5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，接种量100 μL，待细胞培养至融合度70%-80%后，将细胞分为对照组、模型组、阳性组和样品组。样品组分别加入不同浓度的CME，阳性组加入200 μmol/L 抗坏血酸(VC)为阳性对照，孵育24 h后，除对照组外，各组均加入H₂O₂孵育4 h，按1.5.2的方法测定细胞活性。

1.5.5 细胞内活性氧(ROS)水平测定

取对数生长期的细胞按1.2×10⁶个/孔的密度接种于6孔板中，接种量2.5 mL，并按1.5.4的方法进行细胞分组及培养。培养完成后以PBS清洗细胞，按照ROS检测试剂盒说明书操作，使用多功能酶标仪在525 nm发射波长(488 nm激发波长)下检测荧光DCF强度。

1.5.6 细胞内SOD、GSH-Px、CAT和MDA含量的测定

取对数生长期的细胞按1.2×10⁶个/孔的密度接种于6孔板中，接种量2.5 mL，并按1.5.4的方法进行细胞分组及培养。培养完成后收集细胞，并进行细胞裂解收集上清液，按照试剂盒说明书测定HaCaT中SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量。

1.6 统计学分析

用Graphpad软件对结果进行统计分析，测定结果数据均用

\bar{x} \pm s

表示，组间比较采用单因素方差分析(P<0.05差异具有统计学意义)。

2 结果与分析

2.1 CME中主要活性成分分析

蛹虫草的主要活性成分与冬虫夏草较为接近，目前被公认的包括虫草多糖、腺苷、虫草素、多酚、类胡萝卜素等活性成分。本研究通过分光光度法对CME的主要活性成分含量进行了测定(表1)，并采用高效液相色谱法对核苷类成分及单糖组分进行了初步分析。

Table 1 Content of main active components in CME

表1 CME中主要活性成分含量

成分 Components	含量 Content (mg/g)
多糖 Polysaccharide	509.47±14.73
尿苷Uridine	1.21±0.10
鸟苷Guanosine	0.66±0.03
腺苷Adenosine	1.47±0.11
虫草素 Cordycepin	2.66±0.15
N⁶-(2-羟乙基)腺苷 N⁶-(2-hydroxyethtl)-adenosine	2.15±0.09
总多酚 Total polyphenols	9.21±0.37
类胡萝卜素 Carotenoid	0.95±0.04

2.1.1 多糖含量和单糖组成分析

多糖是已报道的蛹虫草抗氧化活性的主要来源(Shweta et al. 2023)。CME中多糖含量达509.47 mg/g (表1)，说明CME活性成分以多糖为主，可预估其有良好的抗氧化活性，与芦叶等(2024)研究结果一致。进一步分析其单糖组成发现(图1)，CME的多糖样品主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，物质的量比为4.58:1.65:5.16:5.23:1.0 (表2)。其中，以甘露糖、葡萄糖和半乳糖3种单糖含量最为突出，与朱丽娜等(2021)的报道一致。甘露糖、葡萄糖和半乳糖作为生物体重要的能量来源，与蛹虫草抗氧化、肝脏保护等功能密切相关(Zhang et al. 2020)，Lan et al. (2024)从蛹虫草中分离出一种主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的多糖CM-1，发现其能有效清除自由基，并对氧化应激具有显著的保护作用。由此可推测甘露糖、葡萄糖和半乳糖可共同作用发挥CME的抗氧化能力。

Fig. 1 Determination of monosaccharide composition by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Tested samples. 1: Man; 2: Rha; 3: Glc-UA; 4: Gal-UA; 5: Lactose (internal standard); 6: Glc; 7: Gal: 8: Xyl; 9: Ara; 10: Fuc.

图1 HPLC检测单糖组成 A：混合对照品；B：供试品. 1：甘露糖；2：鼠李糖；3：葡萄糖醛酸；4：半乳糖醛酸；5：乳糖内标；6：葡萄糖；7：半乳糖；8：木糖；9：阿拉伯糖；10：岩藻糖

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**Table 2 Monosaccharide composition of Cordyceps militaris polysaccharide**

表2 蛹虫草多糖的单糖组成

样品 Sample	甘露糖 Man	半乳糖醛酸 Gal-UA	葡萄糖 Glc	半乳糖 Gal	阿拉伯糖 Ara
含量 Content (mol%)	25.73	9.26	29.01	29.39	5.62

2.1.2 核苷类成分分析

核苷类化合物是蛹虫草有效成分的重要组成部分，目前已成为评价虫草类制品质量控制的重要指标(薛亚甫等 2016)，虫草素和N⁶-(2-羟乙基)腺苷是已报道的蛹虫草中的特有成分(李赫宇等 2018)，对蛹虫草及其提取物的质量控制有重要意义。HPLC分析结果显示(图2)，CME中主要核苷类成分为尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N⁶-(2-羟乙基)腺苷，与李赫宇等(2018)的检测结果一致。其核苷类成分总量为8.15 mg/g，其中，虫草素是CME中含量最高的核苷类成分，为2.66 mg/g，N⁶-(2-羟乙基)腺苷的含量为2.15 mg/g，仅次于虫草素(表1)。

Fig. 2 Determination of nucleosides by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Test sample. 1: Cytidine; 2: Uridine; 3: Guanosine; 4: Thymidine; 5: Adenosine; 6: Cordycepin; 7: N⁶-(2-hydroxyethtl)- adenosine.

图2 HPLC检测核苷类成分 A：混合对照品；B：供试品. 1：胞苷；2：尿苷；3：鸟苷；4：胸苷；5：腺苷；6：虫草素；7：N⁶-(2-羟乙基)腺苷

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2.1.3 其他活性成分

除多糖和核苷类成分外，蛹虫草子实体中还含有其他化学成分，如多酚和类胡萝卜素。用比色法测定CME中多酚和类胡萝卜素含量，分别为9.21 mg/g和0.95 mg/g (表1)。

2.2 CME抗氧化活性评价

本研究通过检测CME对DPPH自由基、ABTS自由基和·OH自由基的清除作用来评价其抗氧化能力(图3)。随着CME浓度的增大，3种自由基的清除率均逐渐增强，且呈明显的量效关系。VC作为一种自由基清除剂，在相同的质量浓度下表现出较强的清除能力，当CME浓度为2.5 mg/mL时对3种自由基的清除效果均接近最佳。CME在浓度为1.5 mg/mL时对DPPH自由基的清除率也已超过90%，接近VC的作用效果(图3A)，其对DPPH自由基的IC₅₀值为0.63 mg/mL。与对DPPH自由基的清除能力相比，CME对ABTS和·OH自由基的清除效果相对较弱，在浓度为2.5 mg/mL时，ABTS和·OH自由基清除率仅为41.64%和39.29%，而当浓度增大到7.5 mg/mL时，清除率均接近90% (图3B, 3C)，说明CME对ABTS和·OH自由基也有较强的清除作用，其IC₅₀值分别为2.97 mg/mL和3.24 mg/mL。

Fig. 3 Scavenging effects of CME on radicals. A: DPPH radical scavenging activities; B: ABTS radical scavenging activities; C: ·OH radical scavenging activities.

图3 CME对自由基的清除作用 A：DPPH自由基清除率；B：ABTS自由基清除率；C：羟基自由基清除率

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2.3 CME对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

2.3.1 对HaCaT细胞活力的影响

采用MTT法对不同浓度(10、25、50、100、200、400、600、1 000 μg/mL) CME作用下的HaCaT细胞存活率进行检测(图4)。随着药物浓度的增加，HaCaT细胞存活力逐渐降低，当质量浓度为50 μg/mL时，细胞存活率为86.27%，当浓度大于50 μg/mL时，细胞活力明显下降，均小于80%。当细胞活力高于80%时可认为样品对细胞未有明显毒性(朱恒杏等 2024)，因此选择10、25、50 μg/mL这3个浓度为安全作用浓度进行后续实验。

Fig. 4 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells.

图4 不同浓度CME对HaCaT细胞活力的影响

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2.3.2 H₂O₂诱导氧化损伤模型建立

H₂O₂作为最重要的活性氧类物质，容易在细胞核组织中扩散，诱导细胞发生氧化应激，已成为国内外研究各类细胞氧化损伤的重要工具(Rachitha et al. 2023)。实验结果显示(图5)，HaCaT的细胞活力随H₂O₂浓度的升高而逐渐降低，当H₂O₂浓度为400 μmol/L时，HaCaT细胞活力降至对照组的59.81% (P<0.01)，此浓度下细胞在受到氧化损伤的同时还保留了相对的活力，因此选择400 μmol/L作为H₂O₂氧化损伤模型的诱导浓度。

Fig. 5 Effects of different concentrations of H₂O₂ on the viabilities of HaCaT cells.

图5 不同浓度H₂O₂对HaCaT细胞活力的影响

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2.3.3 CME对H₂O₂诱导HaCaT细胞活力的影响

MTT法检测CME对H₂O₂处理的氧化损伤HaCaT细胞的保护作用(图6)。400 μmol/L H₂O₂处理细胞后，HaCaT活力显著下降(P<0.01)，降至对照组的55.39%；而经VC和CME预处理的HaCaT细胞活力较模型组明显提高，且与CME浓度呈正相关趋势，当CME浓度为50 μg/mL时，细胞存活率高达83.90% (P<0.01)，较模型组提升了28.51%，与VC的作用效果相近，表明CME对H₂O₂诱导的HaCaT细胞损伤具有明显的保护作用。

Fig. 6 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells induced by H₂O₂. Compared with control group, ^##P<0.01; Compared with model group, ^*P<0.05, ^**P<0.01. The same below.

图6 不同浓度CME对H₂O₂诱导HaCaT细胞活力的影响与对照组相比，^##P<0.01；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，下同

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2.3.4 CME对HaCaT内ROS水平的影响

活性氧(ROS)是细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇(包括单线态氧、超氧阴离子和羟基自由基等)，细胞受到氧化应激刺激后会产生过量的ROS，损伤细胞结构，包括蛋白质、脂质和DNA，从而导致皮肤受损进而造成老化和疾病等皮肤危害(夏世金等 2014)。因此，检测CME对HaCaT中ROS含量的影响可用来评估其防护氧化损伤的能力(图7)，细胞经H₂O₂处理后，ROS相对含量明显升高(P<0.01)，约为对照组的1.6倍，说明H₂O₂处理使HaCaT细胞受到严重的氧化应激损伤，导致了ROS的积累。CME和VC预处理均能显著降低H₂O₂诱导损伤后细胞内ROS水平(P<0.01)，且CME浓度为50 μg/mL时，对ROS抑制率已达到44.46%，抑制效果强于VC。结果表明，CME能够以剂量依赖的方式有效清除H₂O₂刺激而产生的ROS，从而减缓ROS过多导致的氧化损伤。

Fig. 7 Effects of different concentrations of CME on ROS levels in HaCaT cells.

图7 不同浓度CME对HaCaT细胞内ROS水平的影响

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2.3.5 CME对HaCaT内氧化应激因子水平的影响

细胞有一个内源性抗氧化系统，可以通过产生超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶来平衡ROS，抵御脂质过氧化(LPO)、蛋白质氧化、DNA损伤等有害作用对细胞造成的伤害。因此在氧化应激引起细胞损伤的研究中，SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶以及MDA等LPO产物常被用作潜在的生物标志物(Naji et al. 2017；Zhang et al. 2018)。

H₂O₂损伤细胞后，模型组SOD、GSH-Px和CAT活力均显著降低(P<0.01)，分别降至对照组的67.77%、76.59%和68.49% (图8)。CME和VC保护作用下这些抗氧化酶活力均明显上升，特别是当CME浓度为50 μg/mL时，细胞内SOD、GSH-Px和CAT水平分别较模型组显著升高28.91%、22.97%和21.48% (P<0.01)，与VC保护效果相近。脂质过氧化试验表明，HaCaT发生氧化应激会导致细胞脂质损伤加剧，使细胞内MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，50 μg/mL CME以及VC预处理使脂质过氧化程度分别降低29.86%和32.01% (P<0.01)，已恢复至接近正常水平。以上结果表明CME可以通过增加细胞抗氧化酶的活力和阻碍过氧化物的产生来清除自由基，有效地保护HaCaT细胞免受氧化应激损伤。

Fig. 8 Effects of different concentrations of CME on MDA contents (A) and the activities of SOD (B), GSH-Px (C), CAT (D) in HaCaT cells.

图8 不同浓度CME对HaCaT细胞内MDA含量(A)和SOD (B)、GSH-Px (C)、CAT (D)活力的影响

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3 讨论

近年来，应用天然产物来干预氧化应激已经成为皮肤氧化损伤保护的重要研究方向，蛹虫草作为一种药用价值极高的菌物资源，因其广泛的生理活性而受到特别的关注(Ren et al. 2020；何华奇等 2023)。本研究对蛹虫草水提物的主要活性成分进行表征，探究其抗氧化能力以及对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用。

蛹虫草是多糖、多酚、腺苷、虫草素等活性物质的丰富来源。本研究结果表明，CME中多糖(509.47 mg/g)和总多酚(9.21 mg/g)含量显著。总多酚含量与药用菌多酚1.65-19.79 mg/g范围相近(Robaszkiewicz et al. 2010；Choi et al. 2020)，而多糖含量明显高于Thi Nguyen et al. (2022)的报道。此外，CME还含有多种核苷类成分，以腺苷(1.47 mg/g)、虫草素(2.66 mg/g)和N⁶-(2-羟乙基)腺苷(2.15 mg/g)含量最为突出。这些活性产物极大地促进了CME的抗氧化活性。据报道，多糖和酚类化合物可有效清除各种自由基(Barros et al. 2008；Liu et al. 2016)，腺苷能够增强机体抗氧化酶活力(李兵等 2016)，而虫草素具有抑制氧化应激和炎症反应等活性(刘立柱等 2022)，对皮肤具有一定的保护和改善作用。此外，其他可能存在于CME中的化学成分，如类胡萝卜素、麦角硫因和硒，也被证实可明显提高蛹虫草的抗氧化性能(左锦辉等 2018；Shweta et al. 2023)，这些活性成分可能会共同作用对CME的抗氧化活性产生协同效果。因此，推测CME具有很好的抗氧化能力及氧化应激损伤保护作用，在护肤品领域将有巨大的应用潜力。

CME对DPPH自由基有较强的清除作用，IC₅₀值为0.63 mg/mL，隋昕怡等(2024)提取的蛹虫草多糖清除DPPH自由基IC₅₀值为0.80 mg/mL，与之相比，CME对DPPH自由基清除效果更好；与张曦文等(2017)报道的蛹虫草子实体水提物对DPPH自由基IC₅₀为0.757 mg/mL相比也有一定的优势，表明CME具有良好的化学抗氧化活性。在此基础上，我们以H₂O₂诱导HaCaT细胞损伤为模型，探究CME对皮肤氧化损伤的保护作用。结果表明，CME在10、25、50 μg/mL下对HaCaT细胞无明显毒副作用，同时能够提高H₂O₂诱导损伤后的HaCaT细胞存活率并呈剂量依赖性地减弱细胞内ROS水平，与Park et al. (2014)的研究结果一致。H₂O₂是生物体内最常见的活性氧分子，过量H₂O₂刺激皮肤会打破ROS生成和抗氧化酶活性之间的平衡，引起细胞氧化应激并诱导损伤(Masaki 2010)。而抗氧化在细胞水平发挥作用的重要机制之一就是增强抗氧化酶活性，减少脂质代谢产物生成，提高细胞氧化防御体系(郭玉文等 2016)。本研究发现，CME使H₂O₂诱导的HaCaT细胞中抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT水平提高了15%-30%，使MDA抑制率达29.86%，这表明CME在细胞内可通过提高抗氧化酶的活力和降低脂质氧化水平来清除ROS，从而保护HaCaT细胞免受H₂O₂诱导的氧化损伤(Dong et al. 2021)。

本研究通过自由基清除实验和细胞实验证实CME具有较好的抗氧化能力，并对H₂O₂诱导的HaCaT细胞氧化损伤具有保护作用，表明其具有成为天然抗氧化剂应用于化妆品等领域的潜力，为蛹虫草提取物的开发应用提供科学依据。

作者贡献

孙彦庆：查阅文献、初稿撰写；张京良：数据收集与分析管理；朱宗敏：图表制作、软件；江晓路：提供实验材料、文章审核；尚丽丽：验证、实际调查研究；宗雯雯：论文构思、实验设计实施与编辑写作。

利益冲突

作者声明，该研究不存在任何潜在利益冲突的商业或财务关系。

References

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https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.210036

Abstract

Macrofungi, as an important component in forest ecosystems, consist of most members of Basidiomycota and some members of Ascomycota, having important economical value and ecological functions. Extensive field investigations have been carried out in almost whole types of the Chinese forests during the past 30 years, and 112 000 specimens were collected. Based on morphological examination and phylogenetic analyses in combination with ecology and biogeography, 4 250 species belonging to 21 orders in Baidiomycota and Ascomycota were identified, including two new families, four new subfamilies, 69 new genera and 885 new species. Yunnan Province is the richest in macrofungal diversity among provinces or regions in China, and 314 new species were described from this province, accounting for 35% of all the new species described from China by the authors. Our studies have made contributions to deepening the understanding of global diversity of macrofungi. The names of some important Chinese medicinal fungi were revised, the diversity characteristics of Chinese poisonous mushrooms were revealed, and the pathogenetic wood-decaying species were ascertained. These data improved our knowledge on utilization of natural resources and protection of forest health. Based on molecular evidences, the origin of some forest representative fungal genera or species complex were deduced, and their dispersal and speciation were discussed, for the purposes of providing some data for evolutionary study at level of family, order or class of macrofungi henceforth.

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https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.210036

Cited in this article [1] Abstract

大型真菌主要为担子菌门的真菌和少数为子囊菌门的真菌,该类真菌具有重要的经济价值和生态功能,主要生长在森林生态系统中。30年来作者对我国几乎所有类型森林生态中的大型真菌进行了系统调查和采集,共采集标本11.2万号。基于对这些材料的形态学及分子系统学研究,并结合生态学和生物地理学特征,共鉴定出中国森林大型真菌4 250种,隶属于担子菌门和子囊菌门的21个目,发现和发表2个新科、4个新亚科、69个新属和885个新种。云南省是我国森林大型真菌最丰富的省份,描述于该省的新种有314种,占作者发表的全部中国新种的35%。这些研究为深入认识全球大型真菌物种多样性提供了中国的贡献,更新了我国重要食药用菌名称,揭示了我国毒蘑菇多样性基本特征,系统论述了我国森林病原菌的物种多样性,为资源利用、森林健康和保护提供了科学依据;论述了森林大型真菌代表性类群在种和属级水平的起源和演化,为今后开展重要类群科级、目级甚至纲级的系统进化关系提供了重要数据。

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胡梦蝶, 李佳伟, 王梅, 刘彬, 马钰聪, 赵雨露, 杨鑫雷, 崔顺立, 侯名语, 蒋晓霞, 穆国俊, 2022. 花生花斑种皮花青素生物合成相关miRNA及其靶基因鉴定与分析. 植物遗传资源学报, 23(1): 226-239

https://doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20210519001

Cited in this article [1] Abstract

花生在世界粮油食品中占有重要地位，其种皮颜色有白色、红色、紫色、粉红色及花斑等多种颜色，花斑种皮花生是其独特的成员之一，具有便于区分的优良性状。本研究以花斑种皮花生VG-02为研究材料，结果表明与花斑种皮颜色合成相关差异表达的miRNA富集的代谢途径有苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、异黄酮的生物合成，昼夜节律-植物。miRNA测序结果中共筛选出86个差异表达miRNA，其中20个差异表达的miRNA与花生花斑种皮颜色合成相关。与花生花斑种皮花青素合成相关的20个差异表达miRNA包括miR_8、miR_50、miR_51和miR_239-x,这4个是共同靶向花青素、类花青素和IFS靶基因的miRNA；调控CHS靶基因的miR_398-x，调控4CL靶基因的miR_482，调控F3’H靶基因的miR_266和miR_182以及调控花青素3-O-葡萄糖苷靶基因的miR_5，这是5个靶向花青素生物合成中结构基因的miRNA；miR858-y靶向调控MYB2和MYB3,这是1个靶向花青素生物合成调节基因的miRNA；miR_10、miR_15、miR_61、miR_72、miR_102、miR_116、miR_123、miR_193、miR_256和miR_862-z这10个是靶向CYP450靶基因的miRNA。miRNA测序与转录组联合分析KEGG代谢通路表明类黄酮生物合成是花生种皮花斑形成最直接的代谢途径。本研究对于全面揭示花斑花生种皮花青素合成的分子机制有重要意义。

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李海芬, 邱金梅, 陈小平, 洪彦彬, 梁炫强, 2017. 花生花青素合成相关基因的表达与种皮颜色关系. 中国油料作物学报, 39(5): 600-605

https://doi.org/10.7505/j.issn.1007-9084.2017.05.003

Cited in this article [2] Abstract

花生品种种皮颜色与花青素的积累有关，为了探讨花青素合成相关基因表达与种皮颜色的关系，本文采用HPLC和实时荧光定量PCR技术，分析4种不同种皮颜色的花生品种种皮花青素的种类和含量，以及花青素合成相关基因在4个品种5个荚果发育关键时期的差异表达。结果表明：花生种皮的花青素主要由飞燕草色素、矢车菊色素和天竺葵色素等三种色素组成；花生种皮的外观颜色和深浅主要由飞燕草色素和矢车菊色素含量决定，飞燕草色素和矢车菊色素含量越高，种皮颜色越深。花青素合成相关基因主要在种子充实期（开花后约40-50d）上调表达。花生种皮颜色的深浅与查耳酮合成酶基因（CHS）、查尔酮异构酶基因（CHI）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）、类黄酮-3'羟化酶基因（F3'H ）和花色苷合成酶基因（ANS）等基因在种子充实期（开花后约40-50d）高表达显著相关。上述5个基因表达量愈高，种皮颜色愈深。

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刘询, 刘天海, 王波, 贾定洪, 彭卫红, 何晓兰, 2023. 金针菇分子生物学和功能基因研究进展. 菌物学报, 42(1): 130-142

https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.220433

Cited in this article [1] Abstract

金针菇是重要的食药用菌，具有很高的经济价值。随着金针菇全基因组序列的公布、多组学分析、转基因技术、基因编辑技术的发展，越来越多的研究者开始关注金针菇重要性状(如生长速度、菌柄长度、生物活性物质含量等)相关的分子调控机制以及关键基因的发掘。本文综述了分子生物学技术在金针菇研究中的应用并分析了不同技术的利弊;同时，系统介绍了金针菇菌丝和子实体生长发育、温度应答、生物活性物质代谢、蓝光响应等重要生物学过程中调控基因的最新研究进展，并对未来金针菇分子生物学研究的方向进行了展望，旨在为我国金针菇产业的发展提供有价值的参考。

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Funding

SAAS Program for Excellent Research Team([2022]001)

SAAS Program for Acceleration Plan(ZP24161)

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Key words
Cite this article
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 试验材料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.2 蛹虫草水提物的制备
1.3 CME主要活性成分分析
1.3.1 多糖含量及单糖组成
1.3.2 核苷类成分
1.3.3 其他活性成分
1.4 CME抗氧化活性研究
1.5 CME对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用
1.5.1 细胞培养
1.5.2 CME对HaCaT细胞的毒性
1.5.3 HaCaT氧化损伤模型建立
1.5.4 CME对H2O2损伤HaCaT细胞的影响
1.5.5 细胞内活性氧(ROS)水平测定
1.5.6 细胞内SOD、GSH-Px、CAT和MDA含量的测定
1.6 统计学分析
2 结果与分析
2.1 CME中主要活性成分分析
Table 1 Content of main active components in CME
2.1.1 多糖含量和单糖组成分析
Fig. 1 Determination of monosaccharide composition by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Tested samples. 1: Man; 2: Rha; 3: Glc-UA; 4: Gal-UA; 5: Lactose (internal standard); 6: Glc; 7: Gal: 8: Xyl; 9: Ara; 10: Fuc.
Table 2 Monosaccharide composition of Cordyceps militaris polysaccharide
2.1.2 核苷类成分分析
Fig. 2 Determination of nucleosides by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Test sample. 1: Cytidine; 2: Uridine; 3: Guanosine; 4: Thymidine; 5: Adenosine; 6: Cordycepin; 7: N6-(2-hydroxyethtl)- adenosine.
2.1.3 其他活性成分
2.2 CME抗氧化活性评价
Fig. 3 Scavenging effects of CME on radicals. A: DPPH radical scavenging activities; B: ABTS radical scavenging activities; C: ·OH radical scavenging activities.
2.3 CME对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用
2.3.1 对HaCaT细胞活力的影响
Fig. 4 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells.
2.3.2 H2O2诱导氧化损伤模型建立
Fig. 5 Effects of different concentrations of H2O2 on the viabilities of HaCaT cells.
2.3.3 CME对H2O2诱导HaCaT细胞活力的影响
Fig. 6 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells induced by H2O2. Compared with control group, ##P<0.01; Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01. The same below.
2.3.4 CME对HaCaT内ROS水平的影响
Fig. 7 Effects of different concentrations of CME on ROS levels in HaCaT cells.
2.3.5 CME对HaCaT内氧化应激因子水平的影响
Fig. 8 Effects of different concentrations of CME on MDA contents (A) and the activities of SOD (B), GSH-Px (C), CAT (D) in HaCaT cells.
3 讨论
作者贡献
利益冲突
References
Funding

Received	Accepted	Published
2024-09-09	2024-11-18	2025-04-22
Issue Date
2025-04-10

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Key words

Cite this article

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 蛹虫草水提物的制备

1.3 CME主要活性成分分析

1.3.1 多糖含量及单糖组成

1.3.2 核苷类成分

1.3.3 其他活性成分

1.4 CME抗氧化活性研究

1.5 CME对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

1.5.1 细胞培养

1.5.2 CME对HaCaT细胞的毒性

1.5.3 HaCaT氧化损伤模型建立

1.5.4 CME对H2O2损伤HaCaT细胞的影响

1.5.5 细胞内活性氧(ROS)水平测定

1.5.6 细胞内SOD、GSH-Px、CAT和MDA含量的测定

1.6 统计学分析

2 结果与分析

2.1 CME中主要活性成分分析

Table 1 Content of main active components in CME

2.1.1 多糖含量和单糖组成分析

Fig. 1 Determination of monosaccharide composition by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Tested samples. 1: Man; 2: Rha; 3: Glc-UA; 4: Gal-UA; 5: Lactose (internal standard); 6: Glc; 7: Gal: 8: Xyl; 9: Ara; 10: Fuc.

Table 2 Monosaccharide composition of Cordyceps militaris polysaccharide

2.1.2 核苷类成分分析

Fig. 2 Determination of nucleosides by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Test sample. 1: Cytidine; 2: Uridine; 3: Guanosine; 4: Thymidine; 5: Adenosine; 6: Cordycepin; 7: N6-(2-hydroxyethtl)- adenosine.

2.1.3 其他活性成分

2.2 CME抗氧化活性评价

Fig. 3 Scavenging effects of CME on radicals. A: DPPH radical scavenging activities; B: ABTS radical scavenging activities; C: ·OH radical scavenging activities.

2.3 CME对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

2.3.1 对HaCaT细胞活力的影响

Fig. 4 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells.

2.3.2 H2O2诱导氧化损伤模型建立

Fig. 5 Effects of different concentrations of H2O2 on the viabilities of HaCaT cells.

2.3.3 CME对H2O2诱导HaCaT细胞活力的影响

Fig. 6 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells induced by H2O2. Compared with control group, ##P<0.01; Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01. The same below.

2.3.4 CME对HaCaT内ROS水平的影响

Fig. 7 Effects of different concentrations of CME on ROS levels in HaCaT cells.

2.3.5 CME对HaCaT内氧化应激因子水平的影响

Fig. 8 Effects of different concentrations of CME on MDA contents (A) and the activities of SOD (B), GSH-Px (C), CAT (D) in HaCaT cells.

3 讨论

作者贡献

利益冲突

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References

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Footnotes

Funding

1.5.4 CME对H₂O₂损伤HaCaT细胞的影响

**Table 2 Monosaccharide composition of Cordyceps militaris polysaccharide**

Fig. 2 Determination of nucleosides by HPLC. A: Mixed reference substance; B: Test sample. 1: Cytidine; 2: Uridine; 3: Guanosine; 4: Thymidine; 5: Adenosine; 6: Cordycepin; 7: N⁶-(2-hydroxyethtl)- adenosine.

2.3.2 H₂O₂诱导氧化损伤模型建立

Fig. 5 Effects of different concentrations of H₂O₂ on the viabilities of HaCaT cells.

2.3.3 CME对H₂O₂诱导HaCaT细胞活力的影响

Fig. 6 Effects of different concentrations of CME on the viabilities of HaCaT cells induced by H₂O₂. Compared with control group, ^##P<0.01; Compared with model group, ^*P<0.05, ^**P<0.01. The same below.