菌物学报 2015 , 34 (3): 366-374 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.140040

Orginal Article

果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola群体遗传结构研究

朱丹雪¹^,², 周国英¹, 徐建平¹, 刘君昂¹, 李河¹^,^*^,

¹中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室湖南长沙 410004
²中南林业科技大学生命科学与技术学院湖南长沙 410004

Population genetic structure of Colletotrichum fructicola

ZHU Dan-Xue¹^,², ZHOU Guo-Ying¹, XU Jian-Ping¹, LIU Jun-Ang¹, LI He¹^,^*^,

¹Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha, Hunan 410004, China
²College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha, Hunan 410004, China

通讯作者: ^*Corresponding author. E-mail:csuftlihe@163.com^*Corresponding author. E-mail:csuftlihe@163.com

收稿日期: 2014-02-9

接受日期: 2014-04-29

网络出版日期: 2015-05-15

基金资助: 国家自然科学基金（31100479）

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摘要

研究了10个不同地区Colletotrichum fructicola菌株群体遗传结构。145个病菌样品ITS序列可推导出13种单倍体型（haplotype）,其中,Haplotype 5为优势单倍型,有127个菌株。湖北随州地理种群与其他种群遗传分化极大,遗传分化指数（F_ST）为0.14685-0.40385。AMOVA分析显示,种群间和种群内的遗传变异分别占总变异的13%和87%;Mantel测试显示地理距离与遗传分化没有显著的线性关系;该菌经历过种群扩张,群体间存在有效基因流。

关键词： 油茶炭疽病 ; Colletotrichum fructicola ; ITS-5.8S序列 ; 种群遗传结构

Abstract

nrDNA ITS sequences were used to analyze the genetic structure and genetic diversity of Colletotrichum fructicola populations consisting of 145 strains isolated from 10 sites. A total of 13 ITS haplotypes were identified among which the dominant haplotype (haplotype 5) included 127 specimens from the 10 sites. The genetic differentiation index, F_ST, revealed significant genetic differentiation between Suizhou populations and the others. AMOVA test showed that 13% of genetic differentiation occurred among population and 87% within population. The Mantel test showed no linear-correlation between genetic distance and geographical distance. Mismatch distribution analysis suggested there was population expansion for Colletotrichum fructicola and gene flow was detected between populations.

Keywords： oil-tea camellia anthracnose ; Colletotrichum fructicola ; ITS-5.8S sequence ; population genetic structure

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朱丹雪, 周国英, 徐建平, 刘君昂, 李河. 果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola群体遗传结构研究[J]. , 2015, 34(3): 366-374 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.140040

ZHU Dan-Xue, ZHOU Guo-Ying, XU Jian-Ping, LIU Jun-Ang, LI He. Population genetic structure of Colletotrichum fructicola[J]. 菌物学报, 2015, 34(3): 366-374 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.140040

油茶Camellia oleifera Abel.是原产于我国的食用木本油料树种。茶油中不饱和脂肪酸含量高,经常食用可降低血脂、肝脂、减轻血小板聚集力,防止血栓形成,对预防冠心病和防治动脉粥样硬化均有良好的作用（徐学兵 1995）。近几年我国各油茶产区的炭疽病发生严重,引起严重落果、落蕾、枝梢枯死,甚至整株衰亡,造成重大经济损失（靳爱仙等 2009）。目前,国内学者认为油茶炭疽病是由盘长孢状刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.引起（周仲铭 1990;袁嗣令等 1997;杨光道等 2004;沈万芳 2008;刘伟 2012）。我们通过分离病原菌、致病性测验、形态特征和多基因谱系分析,发现Colletotrichum fructicola Prihastuti, L. Cai & K.D. Hyde也能引起油茶炭疽病,而且是主要致病菌,其分布范围十分广阔。据Weir et al.（2012）报道,C. fructicola最早是在泰国的咖啡浆果上发现,随后在日本的沙梨、以色列的补血草、美国的葡萄和草莓以及德国的榕属植物上相继发现。在我国的贵州、云南等其他省份也发现该菌,其寄主包括辣椒、花生、灰莉、西红柿、冬青、葡萄和茶树等（杨友联2010;Peng et al. 2013;张艳敏 2012）。目前,对C. fructicola的研究仅限于种名的确定。本研究拟分析C. fructicola种群遗传结构,这对控制油茶炭疽病具有重要意义。我们将用C. fructicola的ITS-5.8S区序列来分析以下5个方面的问题：第一,来自同一个地区的C. fructicola种群的个体间存在的变异;第二,ITS单倍型在不同地区中的分布规律;第三,C. fructicola不同的地理种群间是否具有显著的遗传分化?如果有,遗传分化的水平与地理距离是否存在明确的关系;第四,C. fructicola种群是否经历过种群扩张;第五,在系统分析中,当与相近种进行比较时,同一地理种群所有C. fructicola菌株是否会紧密地聚为一支。

1 材料与方法

1.1 样品来源

经形态和多基因分子鉴定,确定为果生刺盘孢菌C. fructicola的145个菌株来自10个地区,具体分布为：江西观上（19个）、江西长埠（24个）、海南五指山（5个）、湖南天际岭（12个）、湖南马家河（11个）、湖南浏阳（27个）、湖南怀化（15个）、湖北随州（14个）、福建龙岩（11个）、重庆秀山（7个）。样品采集地点、经纬度等相关信息见表1。

表1 果生刺盘孢菌样品的地理分布及单倍型多样性

Table 1 Geographical distributions and haplotype diversity of Colletotrichum fructicola samples

地区 Site	纬度 Latitude	经度 Longitude	样品数量 Sample size	ITS单倍体型（数量） Haplotype (number)	单倍体型多样性 Haplotype diversity	GenBank接收号 Accession number
江西观上 (JXGS)	28.016	115.659	19	5(18); 9(1)	0.100	KJ131647- KJ131665
江西长埠 (JXCB)	27.564	114.626	24	5(24)	0.000	KJ131672- KJ131695
海南五指山 (HNWZS)	18.780	109.520	5	5(4); 7(1)	0.320	KJ131606- KJ131610
湖南天际岭 (HNTJL)	28.113	113.049	12	5(9); 4(1); 13(1); 2(1)	0.417	KJ131696- KJ131707
湖南马家河 (HNMJH)	27.818	113.043	11	5(9); 6(1); 9(1)	0.314	KJ131708- KJ131718
湖南浏阳 (HNLY)	28.364	113.448	27	5(25); 3(1); 6(1)	0.140	KJ131729- KJ131755
湖南怀化 (HNHH)	28.533	110.967	15	5(14); 10(1)	0.124	KJ131756- KJ131770
湖北随州 (HBSZ)	32.267	113.431	14	5(7); 12(6); 11(1)	0.561	KJ131629- KJ131642
福建龙岩 (FJLY)	25.379	117.301	11	5(10); 8(1)	0.165	KJ131611- KJ131621
重庆秀山 (CQXS)	28.750	109.633	7	5(6); 1(1)	0.245	KJ131622- KJ131628

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1.2 PCR扩增

PCR反应引物（郭亮等 2011）：采用ITS序列通用引物（ITS4：5°-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3°;ITS5：5°-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3°）。PCR反应体系（25μL）：10×缓冲液2.5μL,dNTP（各2.5mmol/L）1μL,引物各1μL,Taq 酶（5U/μL）0.25μL,模板DNA 1μL,ddH₂O 18.25μL。PCR反应条件：95℃变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环;72℃延伸10min;4℃保存。

1.3 测序

PCR产物分别用正反向引物进行双向测序,以保证测序的准确率。测序委托上海博尚生物科技有限公司完成。

1.4 数据分析

采用BioEdit软件（Hall 1999）对DNA序列进行比对和编辑,同时辅以手工矫正。用Mega 5.0（Tamura et al. 2011）软件统计碱基组成、变异位点数等序列特征。使用GenALEx6（Peakall & Smouse 2006）分析各不同地区果生刺盘孢菌群体的ITS单倍型,研究：（1）各不同群体的单倍型多样性;（2）不同地区群体之间的遗传关系;（3）遗传分化与地理隔离的关系。其中,每个单独的群体及群体间的单倍型多样性和群体遗传分化F_ST值分开计算。遗传分化与地理距离的关系使用Mantel 检验法分析（Bonnet & Vander Peer 2002）。地理群体间的距离使用经纬度与坐标共同表示。最后,分子变异分析（analysis of molecular variance,AMOVA）用于估算地理隔离对病菌ITS单倍型分布的相对影响（Excoffier et al. 1992）。用DnaSP 5.0软件（Librado & Rozas 2009）统计ITS序列的核苷酸多样性（nucleotide diversity,Pi）和群体间遗传分化指数（fixation index,F_ST）;根据ITS序列的单倍型频率和核苷酸差异,用 TCS1.21软件（Clement et al. 2000）构建单倍型的网状亲缘关系图。采用DnaSP5.0软件对所有地理种群序列的单倍型错配进行分析。第二种类型的分析中,每个ITS单倍型序列都用于从GenBank中搜索近缘的序列。然后用Clustal W软件（Higgins et al. 1994）对我们的序列及搜索得到的序列进行排列,手工适当校正后用Mega 5.0软件进行分析。使用 Kimura双参数模型,排列中产生的空位（gap）被处理为缺失（missing）构建分子系统发育树（N-J tree）,自展法（Bootstrap,1 000次重复）检验各分支的置信度（Tamura et al. 2004）。

2 结果与分析

2.1 ITS序列多态性和单倍型多样性

病原菌C. fructicola 145个样品的ITS-5.8S rDNA核苷酸序列GenBank接收号、采集地、单倍型分布及其他遗传多样性信息见表1。分析病菌ITS-5.8S区的539bp序列发现,该DNA片段中变异位点14个,简约信息位点5个,单碱基突变位点9个;T、C、A、G的平均含量分别为24.9%、27.5%、23.4%和24.3%,A+T的含量（48.2%）略低于C+G的含量（51.8%）。从病原菌ITS-5.8S nrDNA基因序列14个变异位点,推导出13种单倍型（haplotype）。在13种单倍型中,一个主要单倍型（Haplotype5）包含了绝大部分样品,共127个样品,占总样品数量的88%。单倍型（Haplotype5）分布广泛,全部10个地理种群中均含有该单倍型,说明各地理种群间存在频繁的基因交流。湖南天际岭的样品含有的单倍型最多,有4种单倍型;湖南马家河、湖南浏阳和湖北随州各有3种单倍型;江西观上、海南五指山和湖南怀化均含有2种单倍型;江西长埠和福建龙岩含有的单倍型种类最少,只有一种分布最广的单倍型Haplotype5。同时,除江西长埠外,其他地理种群都拥有自己特有的单倍体型,表明群体内存在独立进化,群体间已呈现一定程度的遗传分化。

果生刺盘孢菌各地理种群,除江西长埠样品只有一种单倍型（Haplotype5）外,其他地区的单倍型多样性在0.100-0.561之间（表1）,其中湖北随州种群的单倍型多样性最高为0.561,湖南天际岭种群的单倍型多样性次之为0.417,表明果生刺盘孢菌在这两个地区具有丰富的多样性;海南五指山、湖南马家河和重庆秀山也具有较为丰富的单倍型多样性。

2.2 单倍型网络分析

利用TCS软件绘制的病菌单倍型网络结构见图1,可以看出病原菌发生了一定的遗传分化,各单倍体型并没有依采样地点形成各自的分支,而是呈现一个非典型星状的发散图。单倍型H5处于辐射中心,推测为原始单倍型;大部分单倍型仅以1或2步突变与H5直接相连,而单倍型H1、H2和H3通过较多突变与H5连接,在位置上显得孤立,暗示果生刺盘孢菌种群曾经发生过种群扩张或起源于较小的奠基种群,从起源地向其他地区的扩张过程中,不同环境条件下的种群受到了不同程度的选择作用,种群因为还未能获得足够的时间建立更加复杂的结构故而呈非典型“星状”。

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图1 果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola ITS-5.8S单倍型网络图

Fig. 1 Parsimony network of the haplotypes of Colletotrichum fructicola. Each mutation is shown as a line between each two haplotypes. Small dots represent unsampled haplotypes.

2.3 遗传分化分析

ITS-5.8S序列的AMOVA分析结果见表2,果生刺盘孢菌种群变异主要发生在种群内,占总变异的87%;而群体间遗传差异较小,占总变异的13%,说明病菌群体间基因交流频繁。病菌种群间和种群内的变异显著大于0,表明果生刺盘孢菌自然种群存在遗传变异（P<0.05）。说明果生刺盘孢菌群体产生了遗传分化,这和单倍型的简约网络图分析结果一致。

表2 果生刺盘孢菌种群内与种群间的AMOVA测试

Table 2 Summary of AMOVA tests within and among population of Colletotrichum fructicola

来源 Source	自由度 df	平方和 SS	离差平方和 MS	估计方差 Est.	在总体变异中占的比值Var.	统计 Stat	数值 Value	概率 Prob
群体间 Among population	9	3.081	0.342	0.017	13%
群体内 Within population	135	14.492	0.107	0.107	87%	PhiPT	0.134	0.010
总数 Total	144	17.572	0.450	0.124

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果生刺盘孢菌不同地理种群间遗传分化F_ST值见表3。根据Wright提出遗传分化指数（F_ST）介于0-0.05之间的种群遗传分化很弱,可不考虑群体间遗传分化;F_ST值介于0.05-0.15之间,群体间存在中等程度遗传分化;F_ST值介于0.15-0.25之间,群体间遗传分化较大;F_ST值大于0.25,表明群体间遗传分化极大（Wright 1978）。从表3中我们可以看出,湖北随州病菌样品（HBSZ）与其他9个地理种群间遗传分化极大,这可能与该地区复杂的环境条件有关,其他9个地理群体互相之间的遗传分化很弱。

表3 果生刺盘孢菌不同地理种群间遗传分化F_ST值

Table 3 Pairwise F_ST value between geographical population of Colletotrichum fructicola

海南五指山 HNWZS	福建龙岩 FJLY	重庆秀山 CQXS	湖北随州 HBSZ	江西观上 JXGS	江西长埠 JXCB	湖南天际岭 HNTJL	湖南马家河 HNMJH	湖南浏阳 HNLY
									HNWZS
0									FJLY
0	0								CQXS
0.29915	0.40385	0.14685							HBSZ
0	0	0	0.36979						JXGS
0	0	0	0.40385	0					JXCB
0.01229	0.01818	-0.05682	0.24122	0.01614	0.01818				HNTJL
0	0	0	0.34842	-0.07143	0	0.01493			HNMJH
0	0	-0.02941	0.33810	0	0	-0.02772	0		HNLY
0	0	0	0.36165	0	0	0.01567	0	0	HNHH

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Mantel测试显示,果生刺盘孢菌地理距离与种群遗传分化之间无显著的线性关系（P>0.05）（图2）。

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图2 病原菌种群间的遗传分化F_ST值与地理距离的线性关系

Fig. 2 Relationship between the levels of genetic differentiation (F_ST value) and geographical distance between pairs of local populations.

2.4 种群扩张分析

对所有果生刺盘孢菌地理种群ITS序列的核苷酸不配对进行分析,分布曲线呈单峰型曲线（图3）,结果说明中国南方油茶主产区的果生刺盘孢菌种群可能经历过种群扩张或“瓶颈效应”,为适应我国南方地区生态环境发展,由一个较小的有效种群形成现在的种群。

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图3 果生刺盘孢菌群体核苷酸不配对分布

Fig. 3 Mismatch distribution of Colletotrichum fructicola population. Exp stands for expected value. Obs stands for observed value.

2.5 基于ITS序列的系统发育分析

我们从GenBank数据库中选择刺盘孢属Colletotrichum不同种的10条ITS序列与实验推导出的13种不同单倍型序列（H1-H13）构建系统发育树（图4）。结果表明,在系统树中没有发现同一个地区的单倍型能聚在一起,而是散乱地分布在系统树中,说明其间存在有效基因流,部分地理种群虽然各自具有独特的单倍型,但各单倍型的差异不大。从系统发育树中,我们还可以看出,13种单倍型序列与GenBank中C. fructicola（JX010177、JX010181、JX010173、JX010182）以100%的置信度聚为一支,由此也验证了我们分离的全部145个菌株都为果生刺盘孢菌。

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图4 基于ITS-5.8S序列的N-J系统树

Fig. 4 A neighbour-joining tree of the ITS sequences.

3 讨论

核糖体DNA内转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）（包括5.8S）是介于18S和26S之间的非编码转录间隔区,承受的选择压力较小,进化速率快,能提供比较丰富的核苷酸变异位点和信息位点,且由于协同进化使得这个片段在不同的重复单元之间十分一致,此外ITS序列片段大小适中,易于测序和分析,近年来被广泛地应用于解决较低分类单元层次上的真菌系统发育问题（Seifert 2009;Bellemain et al. 2010）。Sha et al.（2008）用ITS技术研究云南干巴菌Thelephora ganbajun的遗传多样性,利用通用引物ITS4和ITS5扩增该菌156个个体的ITS区域,结果表明不同地理来源的种群间变异为0.825,种群内变异为0.175,即该菌遗传分化较大。刘诗胤等（2012）利用ITS测序技术研究了浙江地区不同寄主来源炭疽菌的遗传多样性,结果表明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性。刘芳等（2011）应用rDNA-ITS序列分析方法研究悬钩子皮下盘菌种内的遗传多样性,序列比较分析表明,悬钩子皮下盘菌ITS序列长度为443-456bp,G+C含量为48.7%-51.5%;不同菌株间的ITS区序列变异较大,该菌种内遗传多样性丰富。张振等（2009）对陕西省31 株木本植物炭疽菌的rDNA-ITS区序列进行了分析,发现炭疽菌rDNA的ITS区序列存在明显的差异,其ITS-rDNA序列多样性达0.1957,序列长度差异达94bp,通过聚类分析可将其分为不同的遗传类群。因此,炭疽菌rDNA的ITS区序列对种及种下专化型的划分具有一定的意义。本研究利用ITS序列,分析了我国果生刺盘孢菌的种群遗传结构,发现该病菌在我国油茶产区分布十分广泛,单倍型多样性较丰富,存在一定的遗传分化现象。Kelemu et al.（1997）对45个来自南美的圭亚那柱花草盘长孢状刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.进行了RAPD遗传多态性分析,结果表明柱花草盘长孢状刺盘孢菌具有显著多态性,来自长期种植区的菌株的遗传多态性比新植区的丰富,这与本研究中,湖南天际岭和湖北随州这些超过50年树龄的地区病菌单倍型多样性丰富度一致。

本研究中,单倍型Haplotype5在每个群体中均有分布,共127个样品,占总样品数量的88%,即Haplotype5为优势单倍型。说明果生刺盘孢菌具有长距离传递基因流的潜力,病菌在不同地区间扩散的无性繁殖方式导致每个群体中存在相同的基因型,且克隆生长有利于基因型在种群内维持。下一步研究应该针对单倍型Haplotype5菌株,研究开发相应的无公害农药,降低该病害的发生率。此外,果生刺盘孢菌群体核苷酸不配对分布曲线呈单峰型曲线,也暗示该菌种群曾经发生过种群扩张或者起源于较小的奠基种群,从起源地向其他地区的扩张过程。

易克贤等（2003）研究的柱花草盘长孢状刺盘孢菌来自于同一个地理区域的菌株聚成一类或亚类,说明来自不同国家或地区的盘长孢状刺盘孢菌各自具有相对独立的进化途径。但本研究发现,我国果生刺盘孢菌不同单倍体型在系统树中没有发现同一个地理种群的单倍型能聚在一起,而是散乱地分布在系统树中,说明没有地理特异性,且该病菌遗传分化与地理距离之间无显著线性关系。这与刘开启和郭泺（2002）研究17个果树盘长孢状刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.的RAPD分析,同一个遗传聚类组内包括不同地理来源的菌株,而相同寄主来源的菌株又分布于不同遗传聚类组中,显示菌株间的遗传分化地理来源无关的结论相同。本实验研究采集不同地理种群菌株数虽然相差较大,但就现有的样品数量结果,充分说明了果生刺盘孢菌积累了很高的单倍型多样性,说明该病菌对环境变化的潜在适应能力强,容易扩展其分布范围,揭示了我国油茶炭疽病发生面积广和危害程度重。

The authors have declared that no competing interests exist.

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ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an insilico approach reveals potential PCR biases.

2010

... 核糖体DNA内转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）（包括5.8S）是介于18S和26S之间的非编码转录间隔区,承受的选择压力较小,进化速率快,能提供比较丰富的核苷酸变异位点和信息位点,且由于协同进化使得这个片段在不同的重复单元之间十分一致,此外ITS序列片段大小适中,易于测序和分析,近年来被广泛地应用于解决较低分类单元层次上的真菌系统发育问题（Seifert 2009;Bellemain et al. 2010）.Sha et al.（2008）用ITS技术研究云南干巴菌Thelephora ganbajun的遗传多样性,利用通用引物ITS4和ITS5扩增该菌156个个体的ITS区域,结果表明不同地理来源的种群间变异为0.825,种群内变异为0.175,即该菌遗传分化较大.刘诗胤等（2012）利用ITS测序技术研究了浙江地区不同寄主来源炭疽菌的遗传多样性,结果表明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性.刘芳等（2011）应用rDNA-ITS序列分析方法研究悬钩子皮下盘菌种内的遗传多样性,序列比较分析表明,悬钩子皮下盘菌ITS序列长度为443-456bp,G+C含量为48.7%-51.5%;不同菌株间的ITS区序列变异较大,该菌种内遗传多样性丰富.张振等（2009）对陕西省31 株木本植物炭疽菌的rDNA-ITS区序列进行了分析,发现炭疽菌rDNA的ITS区序列存在明显的差异,其ITS-rDNA序列多样性达0.1957,序列长度差异达94bp,通过聚类分析可将其分为不同的遗传类群.因此,炭疽菌rDNA的ITS区序列对种及种下专化型的划分具有一定的意义.本研究利用ITS序列,分析了我国果生刺盘孢菌的种群遗传结构,发现该病菌在我国油茶产区分布十分广泛,单倍型多样性较丰富,存在一定的遗传分化现象.Kelemu et al.（1997）对45个来自南美的圭亚那柱花草盘长孢状刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.进行了RAPD遗传多态性分析,结果表明柱花草盘长孢状刺盘孢菌具有显著多态性,来自长期种植区的菌株的遗传多态性比新植区的丰富,这与本研究中,湖南天际岭和湖北随州这些超过50年树龄的地区病菌单倍型多样性丰富度一致. ...

A software tool for simple and partial Mantel tests.

2002

... 采用BioEdit软件（Hall 1999）对DNA序列进行比对和编辑,同时辅以手工矫正.用Mega 5.0（Tamura et al. 2011）软件统计碱基组成、变异位点数等序列特征.使用GenALEx6（Peakall & Smouse 2006）分析各不同地区果生刺盘孢菌群体的ITS单倍型,研究：（1）各不同群体的单倍型多样性;（2）不同地区群体之间的遗传关系;（3）遗传分化与地理隔离的关系.其中,每个单独的群体及群体间的单倍型多样性和群体遗传分化F_ST值分开计算.遗传分化与地理距离的关系使用Mantel 检验法分析（Bonnet & Vander Peer 2002）.地理群体间的距离使用经纬度与坐标共同表示.最后,分子变异分析（analysis of molecular variance,AMOVA）用于估算地理隔离对病菌ITS单倍型分布的相对影响（Excoffier et al. 1992）.用DnaSP 5.0软件（Librado & Rozas 2009）统计ITS序列的核苷酸多样性（nucleotide diversity,Pi）和群体间遗传分化指数（fixation index,F_ST）;根据ITS序列的单倍型频率和核苷酸差异,用 TCS1.21软件（Clement et al. 2000）构建单倍型的网状亲缘关系图.采用DnaSP5.0软件对所有地理种群序列的单倍型错配进行分析.第二种类型的分析中,每个ITS单倍型序列都用于从GenBank中搜索近缘的序列.然后用Clustal W软件（Higgins et al. 1994）对我们的序列及搜索得到的序列进行排列,手工适当校正后用Mega 5.0软件进行分析.使用 Kimura双参数模型,排列中产生的空位（gap）被处理为缺失（missing）构建分子系统发育树（N-J tree）,自展法（Bootstrap,1 000次重复）检验各分支的置信度（Tamura et al. 2004）. ...

TCS: a computer program to estimate gene genealogies.

2000

Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data.

1992

Genetic diversity of Lactarius deliciosus from South China.

2011

BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.

1999

CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.

1994

Progress, problem and prospect of oil camelliae anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides) research.

2009

Biodiversity, epidemiology and virulence of Colletotrichum gloeosporioides. I. Genetic and pathogenic diversity in Colletotrichum gloeosporioides isolates from Stylosanthes guianensis.

1997

DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data.

2009

ITS sequence analysis of intraspecific genetic diversity of Hypoderma rubi.

2011

RAPD analysis of the pathogenic fungi of anthracnose of fruits.

2002

Polymorphism analysis of Colletotrichum spp. from Zhejiang Province by ITS rDNA PCR-RFLP.

2012

Studies on etiology, occurrence and control of camellia oleifera anthracnose. Master Thesis,

2012

GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research.

2006

Colletotrichum species on grape in Guizhou and Yunnan provinces, China.

2013

... 油茶Camellia oleifera Abel.是原产于我国的食用木本油料树种.茶油中不饱和脂肪酸含量高,经常食用可降低血脂、肝脂、减轻血小板聚集力,防止血栓形成,对预防冠心病和防治动脉粥样硬化均有良好的作用（徐学兵 1995）.近几年我国各油茶产区的炭疽病发生严重,引起严重落果、落蕾、枝梢枯死,甚至整株衰亡,造成重大经济损失（靳爱仙等 2009）.目前,国内学者认为油茶炭疽病是由盘长孢状刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.引起（周仲铭 1990;袁嗣令等 1997;杨光道等 2004;沈万芳 2008;刘伟 2012）.我们通过分离病原菌、致病性测验、形态特征和多基因谱系分析,发现Colletotrichum fructicola Prihastuti, L. Cai & K.D. Hyde也能引起油茶炭疽病,而且是主要致病菌,其分布范围十分广阔.据Weir et al.（2012）报道,C. fructicola最早是在泰国的咖啡浆果上发现,随后在日本的沙梨、以色列的补血草、美国的葡萄和草莓以及德国的榕属植物上相继发现.在我国的贵州、云南等其他省份也发现该菌,其寄主包括辣椒、花生、灰莉、西红柿、冬青、葡萄和茶树等（杨友联2010;Peng et al. 2013;张艳敏 2012）.目前,对C. fructicola的研究仅限于种名的确定.本研究拟分析C. fructicola种群遗传结构,这对控制油茶炭疽病具有重要意义.我们将用C. fructicola的ITS-5.8S区序列来分析以下5个方面的问题：第一,来自同一个地区的C. fructicola种群的个体间存在的变异;第二,ITS单倍型在不同地区中的分布规律;第三,C. fructicola不同的地理种群间是否具有显著的遗传分化?如果有,遗传分化的水平与地理距离是否存在明确的关系;第四,C. fructicola种群是否经历过种群扩张;第五,在系统分析中,当与相近种进行比较时,同一地理种群所有C. fructicola菌株是否会紧密地聚为一支. ...

Progress towards DNA barcoding of fungi.

2009

Genetic diversity of the endemic gourmet mushroom Thelephora ganbajun from south western China.

2008

Resistance mechanism of leave structure to and the influence of the stand and climatic factors to Colletotrichum gloeosporioides. Master Thesis,

2008

Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method.

2004

MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.

2011

The Colletotrichum gloeosporioides species complex.

2012

1978

... 果生刺盘孢菌不同地理种群间遗传分化F_ST值见表3.根据Wright提出遗传分化指数（F_ST）介于0-0.05之间的种群遗传分化很弱,可不考虑群体间遗传分化;F_ST值介于0.05-0.15之间,群体间存在中等程度遗传分化;F_ST值介于0.15-0.25之间,群体间遗传分化较大;F_ST值大于0.25,表明群体间遗传分化极大（Wright 1978）.从表3中我们可以看出,湖北随州病菌样品（HBSZ）与其他9个地理种群间遗传分化极大,这可能与该地区复杂的环境条件有关,其他9个地理群体互相之间的遗传分化很弱. ...

Recent progress of tea seed oil research.

1995

Resistance of main cultivars of oil tea to Colletotrichum gloeosporioides.

2004

Multi-locus phylogeny of Colletotrichum species in Guizhou, Yunnan, and Guanxi, China. PhD Dissertation,

2010

Genetic diversity analysis of Chinese Stylo anthracnose pathogens using random amplified polymorphic DNA.

2003

1997

Diversity survey and phylogenetic study on foliar pathogenic fungi of some ornamental plants of Yunnan. Master Thesis,

2012

ITS-rDNA sequence analysis of Colletotrichum in woody plants in Shanxi Province.

2009

1990

中国南方地区松乳菇遗传多样性分析

2011

... PCR反应引物（郭亮等 2011）：采用ITS序列通用引物（ITS4：5°-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3°;ITS5：5°-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3°）.PCR反应体系（25μL）：10×缓冲液2.5μL,dNTP（各2.5mmol/L）1μL,引物各1μL,Taq 酶（5U/μL）0.25μL,模板DNA 1μL,ddH₂O 18.25μL.PCR反应条件：95℃变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,共36个循环;72℃延伸10min;4℃保存. ...

油茶炭疽病的研究现状、问题与方向

2009

悬钩子皮下盘菌种内遗传多样性的ITS序列分析

2011

果树胶孢炭疽菌的RAPD分析

2002

... 易克贤等（2003）研究的柱花草盘长孢状刺盘孢菌来自于同一个地理区域的菌株聚成一类或亚类,说明来自不同国家或地区的盘长孢状刺盘孢菌各自具有相对独立的进化途径.但本研究发现,我国果生刺盘孢菌不同单倍体型在系统树中没有发现同一个地理种群的单倍型能聚在一起,而是散乱地分布在系统树中,说明没有地理特异性,且该病菌遗传分化与地理距离之间无显著线性关系.这与刘开启和郭泺（2002）研究17个果树盘长孢状刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.的RAPD分析,同一个遗传聚类组内包括不同地理来源的菌株,而相同寄主来源的菌株又分布于不同遗传聚类组中,显示菌株间的遗传分化地理来源无关的结论相同.本实验研究采集不同地理种群菌株数虽然相差较大,但就现有的样品数量结果,充分说明了果生刺盘孢菌积累了很高的单倍型多样性,说明该病菌对环境变化的潜在适应能力强,容易扩展其分布范围,揭示了我国油茶炭疽病发生面积广和危害程度重. ...

浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

2012

油茶炭疽病的病原学、发生规律及防治技术研究

2012

油茶炭疽病发生与林分和气候因素的关系及叶片结构抗病机理的研究

2008

茶油研究进展述评

1995

主要油茶品种对炭疽病的抗性研究

2004

中国贵州、云南、广西炭疽菌属真菌多基因分子系统学研究

2010

中国柱花草炭疽病原菌遗传多态性的RAPD分析

2003

1997

云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究

2012

陕西省31 rDNA-ITS区序列分析

2009

1990

〈

〉

果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola群体遗传结构研究

Population genetic structure of Colletotrichum fructicola

1 材料与方法

1.1 样品来源

1.2 PCR扩增

1.3 测序

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 ITS序列多态性和单倍型多样性

2.2 单倍型网络分析

2.3 遗传分化分析

2.4 种群扩张分析

2.5 基于ITS序列的系统发育分析

3 讨论

参考文献 文献选项 原文顺序 文献年度倒序 文中引用次数倒序 被引期刊影响因子

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文中引用次数倒序

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