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菌物学报  2017 , 36 (2): 154-163 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.160125

Orginal Article

贵州地区茯砖茶“金花菌”的分离和分子鉴定

谭玉梅1, 3, 4, 王亚萍2, 葛永怡2, 任秀秀1, 王玉臣3, 4, 刘作易4, 5, *, 

1贵州大学农学院 贵州 贵阳 550025
2贵州大学生命科学学院 贵州 贵阳 550025
3贵州省生物技术研究所 贵州 贵阳 550006
4贵州省农业生物技术重点实验室 贵州 贵阳 550006
5贵州省农业科学院 贵州 贵阳 550006

Isolation and molecular identification of Aspergillus cristatus in fermented “fuzhuan” brick tea from Guizhou Province

TAN Yu-Mei1, 3, 4, WANG Ya-Ping2, GE Yong-Yi2, REN Xiu-Xiu1, WANG Yu-Chen3, 4, LIU Zuo-Yi4, 5, *, 

1Agricultural College, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China
2College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China
3Guizhou Institute of Biotechnology, Guiyang, Guizhou 550006, China
4Guizhou Key Laboratory for Agricultural Biotechnology, Guiyang, Guizhou 550006, China
5Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang, Guizhou 550006, China

通讯作者:  *Corresponding author. E-mail: gzliuzuoyi@163.com*Corresponding author. E-mail: gzliuzuoyi@163.com

收稿日期: 2016-06-20

接受日期:  2016-09-2

网络出版日期:  2017-02-22

版权声明:  2017 中国科学院微生物研究所《菌物学报》编辑部 版权所有 

基金资助:  贵州省科技厅、贵州省农业科学院联合基金项目（黔科合LH字[2014]7688号）

展开

摘要

本研究对贵州地区茯砖茶中的“金花菌”进行了分离鉴定。通过PCR扩增及测序技术获得转录间隔区序列及部分核糖体大亚基（ITS+LSU）、β-微管蛋白（β-tubulin）、钙调蛋白（CaM）和RNA聚合酶Ⅱ（RPB2）4个基因的序列,然后构建多基因系统树,并对其形态特征进行观察,将其鉴定为冠突曲霉Aspergillus cristatus。

关键词： 冠突散囊菌 ; 冠突曲霉 ; 系统学

Abstract

A tea-fermenting fungus locally named as “jinhua jun” (“golden flower fungus”) was isolated from “fuzhuan” brick tea produced in Guizhou Province and its ITS+LSU, beta tubulin, calmodulin (CaM) and RNA polymerase II (RPB2) gene sequences were amplified. The fungus was identified as Aspergillus cristatus based on the phylogenetic analysis and morphological characteristics.

Keywords： Eurotium cristatum ; Aspergillus cristatus ; phylogenesis

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谭玉梅, 王亚萍, 葛永怡, 任秀秀, 王玉臣, 刘作易. 贵州地区茯砖茶“金花菌”的分离和分子鉴定[J]. , 2017, 36(2): 154-163 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.160125

TAN Yu-Mei, WANG Ya-Ping, GE Yong-Yi, REN Xiu-Xiu, WANG Yu-Chen, LIU Zuo-Yi. Isolation and molecular identification of Aspergillus cristatus in fermented “fuzhuan” brick tea from Guizhou Province[J]. 菌物学报, 2017, 36(2): 154-163 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.160125

茯砖茶属于一种发酵黑茶,至今已有近500年的悠久历史。茯砖茶主销新疆、青海、甘肃、宁夏等边区牧民,由于其特殊的甘甜醇厚的口感及其消腻降脂等药用价值而被他们誉为生命之茶。全国茶产业发展非常迅速,如贵州茶叶种植面积达689万亩,跃居全国第一,但茶叶的综合产值却很低,其重要原因是茶园普遍只采春茶,每年浪费了大量的夏秋茶资源,而生产茯砖茶的原料主要是夏秋茶,因此茯砖茶产业具有发展的巨大潜力。在茯砖茶“发花”过程中,通过控制温度、湿度等条件,促使“金花菌”快速生长繁殖成为优势菌。“金花”的多少是判断茯砖茶品质优劣的重要指标（刘作易等 1991）。但许多茯砖茶厂对加工过程中优势微生物——“金花菌”缺乏了解,造成产品质量不稳定,加工受到季节的限制,发花周期长等问题。贵州地区的“金花菌”是否与其他地区的“金花菌”存在差异,一直以来都没有相关研究报道。

对于“金花菌”的鉴定存在很大争议。早在上个世纪40年代,徐国祯（1941）对安化、径阳等地生产的茯砖茶中的金黄色的菌进行了研究,根据其分生孢子形态初步鉴定为灰绿曲霉群Aspergillus glaucus group。后来,由于国际植物命名法规提出具有有性型菌株应采用有性型的最早合法名称,齐祖同和孙曾美（1990）对该菌重新做了鉴定,根据其有性型命名为冠突散囊菌Eurotium cristatum (Raper & Fennell) Malloch & Cain（1972）,并根据其分生孢子特征命名为小冠曲霉A. cristatellus Kozak,异名针刺曲霉A. spiculosus Blaser,冠突曲霉A. cristatus Raper & Fennell。刘作易等（1990）认为“金花菌”为谢瓦氏曲霉间型变种A. chevalieri var. intermedius Thom & Raper。梁晓岚（1996）研究发现四川茯砖茶发花过程优势菌为谢瓦氏曲霉A. chevalieri Thom & Church。陈云兰（2004）对从湖南、湖北和四川茶厂的总共28份砖茶样品中的优势菌群进行分离鉴定得到17株“金花菌”,其中有15株为冠突散囊菌E. cristatum,2株为谢瓦氏散囊菌E. chevalieri L. Mangin。彭晓赟等（2011）、许爱清（2011）根据湖南地区茯砖茶上“金花菌”的菌落以及子囊孢子、分生孢子的形态特征将其鉴定为冠突散囊菌E. cristatum,与齐祖同的观点一致。由此可见,对于不同地区的茯砖茶“金花菌”的鉴定存在分歧,这可能与茶的不同发酵条件有关,也可能与鉴定所使用的方法及判断标准存在的差异有关。因此,亟需对“金花菌”重新进行准确地鉴定,解决这种一菌多名的问题。本研究采用分子系统学及形态特征两种方法对“金花菌”进行分类鉴定,旨在为茯砖茶的品质提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为贵州湄江印象茶业有限责任公司生产的茯砖（2013年制）,贵州梵锦茶业有限公司生产的康牌茯砖（2012年制）,贵州金瀑农产品开发有限责任公司生产的茯砖（2012年制）,湖南省益阳茶厂生产的茯砖（2012年制）。中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）购买的冠突散囊菌菌株CGMCC3. 6088。

1.2 培养基

PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基,马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15g,蒸馏水1 000mL,pH自然;MYA：麦芽酵母琼脂培养基,麦芽提取物20g,酵母粉5g,蔗糖30g,琼脂15g,加蒸馏水定容至 1 000mL。

1.3 金花菌的分离

将不同来源的茶样在超净工作台中进行紫外杀菌30min,然后分别在茶砖的5个部位用接种针挑取金黄色的菌点,接种于PDA培养基上。将接种好的培养皿放入28℃恒温箱中培养,观察菌落生长情况。形成孢子后进行单胞分离,将最后分离的菌株转接入MYA斜面中,待长成菌落后于4℃冰箱保存,备用。

1.4 PCR扩增

接种子囊孢子液于液体MYA培养基中,28℃摇床培养6d。在超净工作台中过滤收集菌丝,然后使用常规CTAB法提取基因组DNA。采用表1中文献报道的引物及PCR反应程序扩增所选菌株的ITS1+5.8S rDNA+ITS2+650nt LSU rDNA、β-tubulin、CaM和RPB2基因。将PCR产物纯化后连接到pMD- 18-T载体中,转化大肠杆菌DH-5α,将阳性转化子送上海英俊公司测序,所有序列都采用双向测序。

表1   PCR扩增使用的引物

Table 1   Primers used for PCR amplification

基因
Gene		引物名
Primer		引物序列
Primer sequences (5′-3′)		参考文献
References
ITS+LSUITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGWhite et al. 1990; Peterson 2000
D2RGGTCGTTTACGACCATTATG
β-tubulinBt2aGGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTCGlass & Donaldson 1995
Bt2bACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC
CaMCF1LGCTGACTCGTTGACCGAAGAGPeterson et al. 2001
CF4ATTTTTGCATCATGAGCTGAAC
RPB25FGAYGAYMGWGATCAYTTYGGLiu et al. 1999
7CRCCCATRGCTTGYTTRCCCAT

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1.5 数据分析

将测序得到的序列和GenBank中同属的其他种的序列进行比对,下载相似度高的序列,采用Clustal W（Thompson et al. 1994）对基因序列进行比对。比对后的序列采用PAUP*4.0软件（Swofford 2003）以最大简约法（Maximum parsimony,MP）构建系统发育树。系统树文件使用Treeview软件进行编辑处理。

1.6 形态特征观察

1.6.1 菌落特征观察：接种1×106个分生孢子与MYA及高渗MYA（添加17%的NaCl）培养基中,分别于28℃及37℃培养,定期观察记录。

1.6.2 显微形态观察：采用载片培养法,取一张合适大小的滤纸放于平皿底部,上面放一个U形玻棒,再放一张载玻片,盖好皿盖进行灭菌。在上述灭菌平皿内的载玻片中央分别滴加MYA及高渗MYA（添加17%的NaCl）固体培养基少许,并在培养基四周接种孢子悬浮液,加盖盖玻片,并轻轻压贴。分别放在28℃及37℃培养,定期取出在光学显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 基因的扩增

从贵州省3个茶叶公司生产的茯砖茶中分离所有菌株中随机挑选2-3个菌株,菌株编号见表2。将所扩增得到的基因序列都上传至GenBank,其登录号分别为ITS+LSU基因KM388844-KM388854,钙调蛋白基因（CaM）KM388833-KM388843,β-微管蛋白基因（β-tubulin）KM388855-KM388865,RNA聚合酶Ⅱ基因（RPB2）KM388866-KM388876。

表2   供试菌株及其来源

Table 2   Information of the testing strains

菌株号
Strain No.		来源
Source		地点
Location		时间
Time		采集人
Collector
1GZAASM.1011贵州湄江印象茶业有限责任公司贵州湄潭2013.04.25谭玉梅
TAN Yu-Mei
Guizhou Meijiang Impression Tea Industry Co., LTDGuizhou Meitan
2GZAASM.1022贵州湄江印象茶业有限责任公司贵州湄潭2013.04.25谭玉梅
TAN Yu-Mei
Guizhou Meijiang Impression Tea Industry Co., LTDGuizhou Meitan
3GZAASM.1034贵州湄江印象茶业有限责任公司贵州湄潭2013.04.25谭玉梅
TAN Yu-Mei
Guizhou Meijiang Impression Tea Industry Co., LTDGuizhou Meitan
4GZAASS.1009贵州梵锦茶业有限公司贵州铜仁2013.05.14谭玉梅
TAN Yu-Mei
Guizhou Fanjin Tea Industry Co., LTDGuizhou Tongren
5GZAASS.1025贵州梵锦茶业有限公司贵州铜仁2013.05.14谭玉梅
TAN Yu-Mei
Guizhou Fanjin Tea Industry Co., LTDGuizhou Tongren
6GZAASS.1027贵州梵锦茶业有限公司贵州铜仁2013.05.14谭玉梅
TAN Yu-Mei
Guizhou Fanjin Tea Industry Co., LTDGuizhou Tongren
7GZAASA.1012贵州金瀑农产品开发有限责任公司贵州安顺2013.05.23刘永翔
LIU Yong-Xiang
Guizhou Jinpu Agricultural Development Co., LTDGuizhou Anshun
8GZAASA.1024贵州金瀑农产品开发有限责任公司贵州安顺2013.05.23刘永翔
LIU Yong-Xiang
Guizhou Jinpu Agricultural Development Co., LTDGuizhou Anshun
9GZAAS20.1001湖南省益阳茶厂有限公司湖南益阳2013.05.23葛永怡
GE Yong-Yi
Hunan Yiyang Tea Industry Co., LTDHunan Yiyang
10GZAAS20.1004湖南省益阳茶厂有限公司湖南益阳2012.09.12葛永怡
GE Yong-Yi
Hunan Yiyang Tea Industry Co., LTDHunan Yiyang
11CGMCC3.6088中国科学院微生物研究所微生物资源中心未知2009.8.24未知
Unknown
China General Microbiological Culture Collection CenterUnknown

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2.2 系统树分析

从GenBank下载相关模式菌株或公认菌株的相应基因的序列（表3）,以Eurotium halophilicum type NRRL 2739为外源群,用PAUP软件采用最大简约法构建系统树（图1）,其树长（Tree length）=1 075;一致性指数（CI）=0.798;保留指数（RI）=0.908;复定指数（RCI）=0.725;同型指数（HI）=0.202。贵州地区的8株“金花菌”与冠突散囊菌菌株CGMCC3.6088及湖南益阳茶厂分离的两株菌GZAAS20.1001和GZAAS20. 1004都与许爱清2009年从湖南益阳茶厂生产的茯砖茶中分离的优势菌E. cristatum FZ HQ148162（Xu et al. 2011）以94%的支持率聚在一起,这些菌又与在南非采集的冠突散囊菌的标准菌株 E. cristatum NRRL 4222以100%的支持率聚在一起（图1）。

表3   GenBank中下载的散囊菌属近缘种相应序列

Table 3   GenBank accession numbers of the four genes of Eurotium spp.

菌株
Strains		ITS+LSU基因
ITS+LSU		β-微管蛋白
β-tubulin		钙调蛋白
Calmodulin		RNA聚合酶Ⅱ
RNA PolymeraseⅡ
1E. amstelodami NRRL 90EF652076EF651897EF652017EF651963
2E. amstelodami NRRL 4716EF652079EF651899EF652018EF651965
2E. carnoyi NRRL126EF652057EF651903EF651985EF651942
3E. chevalieri NRRL 78EF652068EF651911EF652002EF651954
4E. chevalieri NRRL 4755EF652071EF651913EF652004EF651956
5E. cristatum NRRL 4222EF652078EF651914EF652001EF651957
6E. sp. FZ HQ 148162HQ148160HQ148162HQ148163HQ148161
7E. echinulatum NRRL 131EF652060EF651907EF651998EF651939
8E. echinulatum NRRL 133EF652061EF651908EF651999EF651940
9E. halophilicum NRRL 2739EF652088EF651926EF652034EF651982
10E. herbariorum NRRL 116EF652052EF651887EF651989EF651934
11E. herbariorum NRRL 117EF652053EF651888EF651990EF651935
12E. intermedium NRRL 82EF652074EF651892EF652012EF651958
13E. intermedium NRRL 4817EF652070EF651894EF652014EF651960
14E. leucocarpum NRRL 3497EF652087EF651925EF652023EF651972
15E. niveoglaucum NRRL 127EF652058EF651905EF651993EF651943
16E. niveoglaucum NRRL 137EF652063EF651910EF651996EF651945
17E. repens NRRL 13EF652048EF651915EF652005EF651950
18E. repens NRRL 17EF652049EF651916EF652006EF651951
19E. rubrum NRRL 52EF652066EF651920EF652009EF651947
20E. rubrum NRRL 76EF652067EF651921EF652011EF651948
21E. tonophilum NRRL 5124EF652081EF651919EF652000EF651969
22E. xerophilum NRRL 6131EF652085EF651923EF651983EF651970
23E. xerophilum NRRL 6132EF652086EF651924EF651984EF651971

Note: The type strains were indicated in bold.注：模式菌株加粗表示.

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图1   基于ITS+LSU,β-tubulin,CaM及RPB2的序列构建的多基因系统树树分支上的值为bootstrap值,模式菌株加粗表示

Fig. 1   Phylogram derived from combined ITS+LSU, β-tubulin, CaM and RPB2 data.Numbers at the nodes are the bootstrap value, and the type strains were indicated in bold.

2.3 形态特征观察

2.3.1 有性阶段：在MYA培养基上28℃培养2d长出菌落,7d菌落直径为17-19mm,菌落四周边缘为浅黄色菌丝体,菌落中央部分颜色较深,近于橄榄褐色,14d后变成褐色（图2A）,产生大量黄色的闭囊壳（图2B）,球形或近球形,菌落中央具大量的水珠状的黑褐色渗出液,在体视镜下观察没有分生孢子,菌落反面黑褐色,色素扩散于培养基中。在光学显微镜下观察,闭囊壳破碎后释放出8孢子囊和子囊孢子（图2E,F）,子囊孢子横轴的大小为4.5-5.5μm。

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图2   冠突曲霉（有性阶段）A：菌落（MYA培养基上28℃培养7d）;B：菌落表面的闭囊壳;C：未成熟的闭囊壳;D：闭囊壳;E：成熟的子囊;F：子囊孢子

Fig. 2   Aspergillus cristatus (sexual state).A: A colony on MYA at 28°C after 7d; B: Immature cleistothecia on MYA; C: Immature cleistothecia; D: Cleistothecia; E: Mature ascus; F: Ascospores.

2.3.2 无性阶段：在高渗MYA培养基上37℃培养2d长出菌落,7d菌落直径为11-13mm,菌落四周边缘为浅绿色菌丝体,菌落为灰绿色（图3A）,见大量的气生菌丝及分生孢子头（图3B）。菌落反面为白色,在光学显微镜下观察分生孢子梗单生,偶见分枝（图3D）,分生孢子串生,呈椭球形或球形,少数近球形,大小为3.5-4.5μm。

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图3   冠突曲霉（无性阶段）A：菌落（MYA培养基上37℃培养7d）;B：菌落表面的分生孢子头;C：正在发育的顶囊;D：瓶梗上长出的未成熟分生孢子;E：串生的分生孢子;F：分生孢子

Fig. 3   Aspergillus cristatus (asexual state).A: A colony on MYA at 37°C after 7d; B: Conidial heads on MYA; C: Developing vesicle; D: Immature conidia at tips of phialides; E: Conidial head; F: Conidia.

3 讨论

对于茯砖茶中“金花菌”的分离鉴定一直存在分歧,其主要集中在冠突散囊菌Eurotium crsitatum,谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri,谢瓦氏曲霉间型变种A. chevalieri var. Intermedius 3个种名。它们都能产生金黄色的闭囊壳,冠突散囊菌与谢瓦氏曲霉间型变种子囊孢子及分生孢子的形态特征非常相似,两者的区别仅在于子囊孢子的大小略有不同（冠突散囊菌4.5-5.5μm,谢瓦氏曲霉间型变种3-4.5μm）（Hubka et al. 2013）,谢瓦氏曲霉与其他两个菌的区别在于分生孢子表面是否光滑,但彭晓赟等（2011）提出这与分生孢子的不同成熟度有关,是一个不稳定的特征。由于这3个种的形态特征相似,不同的培养条件及测定方法,可能得出不同的鉴定结果,所以仅依靠形态学的方法很难准确地对“金花菌”进行鉴定,而多基因系统发育分析能够提供更加准确的鉴定依据（Hubka et al. 2013）。Peterson（2008）用β-tubulin,CaM,ID,RPB2的序列构建系统树可以准确地将460种曲霉区分开来。本研究采用此方法构建的系统树结果显示获得的“金花菌”菌株与模式菌株E. cristatum NRRL 4222聚在一起,与谢瓦氏曲霉和谢瓦氏曲霉间型变种处在不同的分枝上。

根据“The genus Aspergillus”（Raper & Fennell 1965）冠突散囊菌最早的命名为冠突曲霉A. crsitatus。一直以来,分类学家把针刺曲霉A. spiculosus作为冠突散囊菌的异名（Pitt 1985;Samson & Gams 1985;齐祖同和孙曾美 1990;Pitt et al. 2000）,但Hubka et al.（2013）通过构建多基因（ID,benA,CaM,RPB2）系统树发现针刺曲霉为谢瓦氏曲霉间型变种的异名。冠突散囊菌还有一个异名为小冠曲霉A. cristatellus（Kozakiewicz 1989;Hubka et al. 2013）。对于冠突散囊菌这种多型菌（有性型为散囊菌,无性型为曲霉）存在多个名称,在分类学上造成很大的不便。根据2011年7月在墨尔本举行的国际植物学大会提出了“一个真菌,一个名称”的设想,以及命名法规的优先权原则（Kirk et al. 2011）,Hubka et al.（2013）认为应该用曲霉的名称取代散囊菌的名称,以曲霉命名具有有性型的真菌已经应用到Aspergillus、Fumigati、Terrei及Usti section中（Samson et al. 2011;Hong et al. 2011;Horn et al. 2009;Hubka et al. 2012）,如人们所熟知的构巢曲霉A. nidulans、黄曲霉A. flavus、烟曲霉A. fumigatus等,而且这项提议在2012年青霉和曲霉国际委员会大会上（the International Commission on Penicillium and Aspergillus,ICPA）也获得了大多数人的支持（Hubka et al. 2013）。所以根据新的命名规则,“金花菌”的命名应用其无性型曲霉的名称（王磊等 2015）,由于冠突曲霉A. crsitatus在1965年就有了合法有效的名称（Raper & Fennell 1965）,而小冠曲霉A. cristatellus（Kozakiewicz 1989）在1989年才开始使用,根据命名优先权原则将贵州及湖南茯砖茶中的“金花菌”鉴定为冠突曲霉A. crsitatus。

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