灵芝是担子菌门、伞菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌,具有极高的药用价值（Cao et al. 2012;戴玉成等 2013）,灵芝的化学成分复杂,包括多糖、三萜、甾醇、生物碱、氨基酸、脂肪酸等。其中灵芝三萜具有抗肿瘤、抗HIV-1型病毒、护肝、解毒和改善记忆力等多种功效（Ko et al. 2008;Chen & Zhong 2009;Liu et al. 2012;Liu et al. 2014）,是衡量灵芝产品品质高低的重要指标之一。灵芝孢子粉是子实体发育成熟期从灵芝菌褶中弹射出来的生殖细胞,含有脂肪酸类、三萜酸类、多糖类等多种化学成分。

近年来,随着孢子粉收集和破壁技术的发展,灵芝孢子粉的药理作用已经受到消费者的广泛认可,但其中的标志性有效成分尚不明确,且缺乏法定的标准,孢子粉及相关产品常用灵芝子实体中的活性成分三萜或多糖作为质控指标,运用分光光度计法（陈冠州等 2011）进行测定。但是孢子粉和孢子油中含有大量的油酸、亚油酸、麦角甾醇等成分,都可以与香草醛高氯酸发生颜色反应,使三萜测定结果远远高于真实值（张忠等 2016）。文献报道,运用分光光度法测得破壁孢子粉三萜含量为2.94%-3.43%（叶银鹏等 2017）,孢子油三萜含量高于20%（李菁等 2012）。运用高效液相色谱法（董虹玲等 2013;周丹英等 2017）研究发现,市售灵芝孢子粉中灵芝酸类成分含量非常低,有些甚至检测不出。两种主流检测方法测定结果的差异,使得灵芝孢子粉中是否含有三萜和三萜的具体含量备受争议,本文在已有研究的基础上,排除油脂及麦角甾醇等成分的干扰,对灵芝孢子粉的前处理方法和分析条件进行优化,建立适合灵芝孢子粉中三萜分析测定的HPLC方法,为评价灵芝孢子粉的质量提供科学依据。

1.1.1 材料：灵芝孢子粉样品均由上海百信生物科技有限公司提供,其中1-3号样品来自浙江,4号及5号样品产自安徽;5个样品均进行破壁处理,分为未破壁及破壁孢子粉样品;灵芝孢子油样品均为实体购买。

1.1.2 试剂：无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、冰醋酸均为国药集团化学试剂有限公司分析纯试剂;高效液相用乙腈为美国Dikma公司色谱纯;水为超纯水。

1.1.3 仪器与设备：Waters1525高效液相色谱仪,Waters2489紫外检测器,美国Waters公司;Omni Bond Hubble C18（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱,天津欧姆尼基因科技有限公司;KQ-2200E型超声清洗器（工作功率100W,频率40kHz）,昆山市超声仪器有限公司;MS105DU电子分析天平,瑞士Metter Toledo公司;可试氮气吹扫仪,上海乔跃电子有限公司;旋转蒸发仪,Buchi公司。

1.2.1 色谱条件优化：考察不同色谱柱对三萜类成分的分离效果,选择分离效果最佳的色谱柱;以乙腈-醋酸水溶液（0.01%）为流动相,优化洗脱条件,确定最佳的洗脱程序;色谱条件为：流速1.0mL/min,检测波长为252nm,柱温30℃,进样量10μL。

1.2.2 对照品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的标准品：灵芝酸I、灵芝烯酸C、灵芝酸C2、灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝烯酸E、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸D、灵芝酸F,分别加甲醇配制成1mg/mL的标准品储备液。精密吸取适量各标准品储备液,制成含混合标准品溶液,摇匀,并稀释成7个系列浓度混合标准品溶液,备用。

1.2.3 样品前处理条件的优化：参考贾红岩等（2017）测定灵芝子实体三萜的提取方法,灵芝孢子粉按料液比1:10用乙醇提取,并分别考察提取液浓缩比、提取溶剂（乙醇、甲醇、正己烷、石油醚、乙酸乙酯）对三萜提取效率的影响,优化出最佳提取方案。

2.1.1 提取液浓缩比的确定：按贾红岩等（2017）的测定方法,对灵芝孢子粉进行分析测定（图1）,结果发现灵芝孢子粉中三萜含量低于检测限,无法进行定量分析。为准确测定灵芝孢子粉中三萜类成分的含量,对提取液进行浓缩,分别对浓缩10倍、20倍、50倍、100倍后的样品进行分析,发现当提取液浓缩大于50倍后,图谱中三萜类成分峰形明显、在定量分析范围,因此样品前处理中需要加上浓缩50倍的步骤。

2.1.2 破壁处理对灵芝孢子粉中三萜含量的影响：破壁前后灵芝孢子粉中三萜类化合物的HPLC色谱图见图2,结果发现破壁与未破壁孢子粉中HPLC图谱在10-22min中等极性色谱峰的组成和含量类似,而在24-34min弱极性色谱峰中,破壁孢子粉的种类和含量明显多于未破壁孢子粉。Min et al.（2000）报道破壁灵芝孢子粉中分离纯化得到的三萜主要为中等极性三萜酸类化合物,同时与标准品比对,10-22min的峰主要为三萜类化合物。另外,破壁处理使甘油三酯、脂肪酸、甾醇（Zhang et al. 2008）等弱极性化合物大量溶出,也会干扰弱极性三萜类化合物的定性定量分析。破壁孢子粉的ELSD图谱进一步证实提取过程中有大量的弱极性化合物溶出,干扰弱极性三萜类化合物的定性定量分析,这部分三萜由于干扰物质多,难以分离,目前测定较困难。因此,本研究仅对孢子粉中中等极性三萜酸类化合物进行分析测定。

2.1.3 提取溶剂的优化：破壁孢子粉含油率不低于20%（姚仲青等 2007）,因此破壁孢子粉提取液浓缩后有大量的孢子油析出,影响样品溶液的浓缩定容,且大量的油脂会污染色谱柱和检测器,影响破壁孢子粉中三萜类成分的测定分析。因此样品前处理中要去除大部分孢子油的影响,对提取溶剂进行考察。以破壁孢子粉为材料,对乙醇、甲醇、正己烷、石油醚、乙酸乙酯提取物进行HPLC分析比较（图3A）,结果发现以乙醇和甲醇为提取剂时中等极性三萜的提取率最高、且油脂的溶出相对较少;乙酸乙酯作为提取剂时,三萜和油脂都有大量的溶出;以正己烷、石油醚为提取剂时,油脂的溶出量最多、而三萜类成分几乎未检出。综合考虑三萜提取率、油脂溶出量和实验安全性,乙醇为孢子粉三萜测定较为合适的提取溶剂。

在乙醇为溶剂的基础上,对提取方案进一步优化,以尽量减少孢子油的溶出,分别选择20%、30%、40%、50%乙醇水溶液作为提取剂进行提取,HPLC分析结果见图3B。结果发现随着乙醇浓度增加,10-22min中等极性三萜的总峰面积先增加后减少,醇浓度为40%时总峰面积最大,无水乙醇提取的总峰面积最小,可能是因为乙醇浓度越高油脂的溶出越多,大量的油脂会影响样品的浓缩和回收。而用正己烷、石油醚脱脂后的孢子粉残渣分别用无水乙醇进行提取,与直接40%醇提样品对比,三者三萜峰的数量和面积基本一致,即40%乙醇已经可以使孢子粉中的三萜类成分充分溶出,进一步验证了40%乙醇的三萜提取效果。综合考虑三萜的提取率和油脂的溶出率,40%乙醇在保证三萜提取率的前提下,最大限度地减少了油脂的溶出,最终选择以40%乙醇为最佳的提取溶剂。

2.1.4 孢子粉三萜测定前处理条件的确定：破壁孢子粉样品以40%乙醇水溶液为提取溶剂（未破壁孢子粉样品,因不存在油脂的干扰,可直接以无水乙醇为提取溶剂）,按料液比1:10进行超声提取30min,冷却至室温,摇匀,4 000r/min离心15min,取上清液,浓缩旋干,按50倍浓缩比用乙醇定容,过0.22μm微孔有机相滤膜,备用。

考察3种不同型号的色谱柱Agilent ZORBAX SB-C₁₈（4.6mm×250mm,5μm）、Waters CORTECS- C₁₈色谱柱（150mm×4.6mm,2.7μm）和HUBBLE-C₁₈（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱,通过对比分析3根色谱柱对同一供试样品的测定结果,最终选择具有最佳分离效果的HUBBLE-C₁₈（4.6mm×250mm,5μm）为本实验用色谱柱,并对其洗脱条件进行优化,最终得到的最佳梯度洗脱程序如下：乙腈（A）-（0.01%）醋酸水溶液（B）：0→5min,22% A;10min,35% A;30min,40% A;32min,42% A;37min,45% A;45min,65% A;55→60min,100% A。在该色谱条件下,各色谱峰分离较好（图4）。

2.3.1 线性关系：取1.2.2中6个系列浓度标准品溶液,按2.2色谱条件依次进样分析,记录峰面积。以各对照品浓度为横坐标（X）,峰面积为纵坐标（Y）,绘制标准曲线,得到各三萜组分的线性回归方程和线性范围。结果表明13种三萜在线性范围内相关系数均大于0.999,线性关系良好（表1）。

2.3.2 精密度、重复性和稳定性试验：取1.2.2中的同一混合对照品溶液,连续进样6次,计算每次测得的各三萜峰面积的R.S.D.,考察仪器精密度;取同一孢子粉样品,精密称取6份,按2.1.4方法平行制备供试品溶液,计算每份样品测得的各三萜含量,求出R.S.D.,考察方法重复性;取同一供试品溶液,分别在提取0、2、4、6、8、12、24h后进样测定,计算每次测得的各三萜峰面积R.S.D.,考察样品稳定性。结果表明,各R.S.D.均小于5%,表明仪器精密度、方法重复性、样品24h稳定性均良好（表1）。

取各待测样品,按2.1.4方法制备供试样品溶液,按2.2下色谱条件测定,外标曲线法计算各样品中三萜含量,每个样品平行2份,结果见表2及表3,显示孢子粉和孢子油中13种三萜类成分含量都是微量级,未破壁孢子粉三萜总量为14.24-93.12μg/g,破壁孢子粉三萜总量为20.43-99.70μg/g,而孢子油中三萜总量不足50.0μg/g（表4）;三萜类成分的溶出量与是否破壁没有相关性。分析5组未破壁及破壁孢子粉中的三萜含量及组成,发现灵芝酸A的含量最高,占各样品中三萜总量的15.43%-23.25%,平均达19.71%,是孢子粉中含量最高的三萜类成分;灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸D、灵芝酸F的平均含量均达到各样品三萜总量的10%以上;该5种三萜的总量占各样品中测定三萜总量的62.07%-69.19%,平均达66.20%,是孢子粉中的主要三萜类成分;灵芝酸I、灵芝烯酸C和灵芝烯酸E含量极其微量,三者之和占各样品三萜总量的平均值为2.58%。

本研究在灵芝子实体中三萜测定HPLC方法的基础上,对孢子粉中的主要三萜即中等极性三萜酸类化合物进行分析测定。根据灵芝孢子粉的特性,优化了提取液浓缩比、提取溶剂、色谱条件等对灵芝孢子粉中三萜测定的影响,最终确定最佳提取方案：以40%乙醇水溶液为提取溶剂、提取液浓缩50倍进行HPLC分析,实现了灵芝孢子粉中13种三萜类成分的含量测定,其精密度、重复性、稳定性良好,可靠性强,可用于孢子粉中三萜含量测定。方法排除了油酸、亚油酸、麦角甾醇等低极性脂溶性成分的干扰,明确了灵芝孢子粉中含有三萜,但13种三萜的总量仅为14.24-99.70μg/g,含量很低,仅为子实体的1/100,而灵芝孢子油中三萜含量不足50μg/g,因此不建议三萜作为灵芝孢子粉及其相关产品的检测指标。另一方面,本研究也验证了分光光度法会使孢子粉中三萜的测定结果严重偏高,呈现假阳性,所以分光光度法并不适合灵芝孢子粉及其相关产品中三萜类含量的测定。

灵芝孢子粉产品一般均需进行破壁处理,破壁后灵芝孢子油才能有效释放。实验室前期研究已经表明,破壁与否对孢子粉中核苷类成分的溶出影响不大（王金艳等 2013）,但破壁处理可以有效促进孢子粉中麦角甾醇及脂溶性成分的溶出（王金艳等 2018）。本文对比分析了5组未破壁及破壁孢子粉中的三萜含量及组成,发现三萜类成分的溶出量与是否破壁没有相关性;另外,数据表明灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F是灵芝孢子粉中的主要三萜类成分,其中灵芝酸A平均占样品三萜总量的19.71%,是孢子粉中含量最高的三萜类成分。