有孢汉逊酵母属,拉丁学名为Hanseniaspora,其无性阶段为Kloeckera,该属酵母细胞呈典型的柠檬形,是葡萄酒发酵初期出现的主导野生酵母菌属之一。随着不同葡萄酒产区微生物风土概念的提出,研究者们对野生酵母菌的关注不再仅局限于具有优良发酵特性的酿酒酵母,而且更加关注具有风味特色或复杂性的非酿酒酵母的研究（Jolly et al. 2014;Masneuf-Pomarede et al. 2016）。有孢汉逊酵母属作为分布十分普遍的主导野生非酿酒酵母菌,近年来经研究发现具有高产乙酸乙酯（Fleet 2008;Masneuf-Pomarede et al. 2016）、分泌糖苷酶增加葡萄酒香气（陶永胜等 2016;Hu et al. 2018;Hu et al. 2019）、提高香气含量和香气复杂性（Moreira et al. 2008;原苗苗等 2018）等优良葡萄酒酿造特性。对具有混合接种发酵应用潜力的有孢汉逊酵母属进行分子指纹图谱分析,是开发利用该属酵母菌资源的基础,对选育优良有孢汉逊酵母及应用分子指纹特征进行监控具有重要意义。

葡萄酒发酵过程中有孢汉逊酵母属的分离和鉴定,主要通过一系列依赖于培养的方法来实现菌种水平的分类鉴定,具体包含WL营养培养基、序列分析和5.8S-ITS-RFLP分析（Wang & Liu 2013;Wang et al. 2019）。WL营养培养基可以同时实现有孢汉逊酵母属酵母菌的分离和分类,研究显示有孢汉逊酵母属酵母在该培养基上的菌落特征为菌落扁平,表面光滑不透明,黄油状,菌落颜色呈中央黄绿至深绿色边缘白色,但不同种或同种不同菌株呈现不同比例的深绿色和白色边缘（Wang & Liu 2013;Wang et al. 2019）。酵母菌菌种水平经典序列分析方法主要是26S rRNA基因D1/D2区域序列分析和5.8S rRNA基因ITS区域序列分析两种表明,当26S rRNA基因D1/D2区域序列差异超过1%即6个核苷酸不同时,证明两个序列分属不同的种。然而,这两种经典序列分析方法表明7个有孢汉逊酵母属的酵母菌种属于近缘种,包含H. uvarum (Niehaus) Shehata, Mrak & Phaff ex M.Th. Smith、H. opuntiae Cadez, Poot, Raspor & M.Th. Smith、H. guilliermondii Pijper、H. clermontiae Cadez, Poot, Raspor & M.Th. Smith、H. lachancei Cadez, Poot, Raspor & M.Th. Smith、H. pseudoguilliermondii Cadez, Raspor & M.Th. Smith和H. meyeri Cadez, Poot, Raspor & M.Th. Smith（Cadez et al. 2003）,它们的26S rRNA基因D1/D2区域序列差异不超过1%,虽然在5.8S rRNA基因ITS区域展现出不同的核苷酸替代率,但无法成为近缘种菌种鉴定的直接依据。Cadez et al.（2006）进一步采用了多基因序列分析方法证明有孢汉逊酵母属内11个种以4个遗传聚类组存在,每个组由近缘种聚类构成,上述7个种组成其中的一个遗传聚类组。目前有孢汉逊酵母属内种间的遗传关系仍以Cadez et al.（2006）构建的聚类图为准（Cadez & Smith 2011）,但是该聚类图没有包含Jindamorakot et al.（2009）报道的2个有孢汉逊酵母属新种H. singularis indamorakot, Ninomiya, Limtong, Kawasaki & Nakase和H. thailandica indamorakot, Ninomiya, Limtong, Kawasaki & Nakase。近年来测序技术的进步推动了更多酵母菌种的基因组序列研究,Sternes et al.（2016）公布了H. uvarum、H. opuntiae和H. osmophila (Niehaus) Phaff, M.W. Miller & Shifrine ex M.Th. Smith的基因组序列,表明前两者的基因组大小和预测蛋白含量相似性较大且类似于已经公布的H. valbyensis Klöcker、H. osmophila的基因组信息明显不同于前两者,但与已公布的H. vineae相似,该结论与Cadez et al.（2006）的遗传关系图一致。随着更多的有孢汉逊酵母属酵母的基因组和转录组信息的公布和比较基因组分析（Seixas et al. 2017;Chen et al. 2019;Giorello et al. 2019;Seixas et al. 2019）,该属酵母的序列分析方法期待得到进一步的完善。此外,5.8S-ITS-RFLP分析是可以替代5.8S rRNA基因ITS区域序列分析的一种快速鉴定方法,广泛在酵母菌种鉴定中使用,甚至可以用来区分有孢汉逊酵母属近缘种,如MboII限制性内切酶可以将H. uvarum和H. meyeri、H. opuntiae和H. guilliermondii分别区分开,HinfI限制性内切酶可以将H. pseudoguilliermondii与H. opuntiae和H. guilliermondii区分开（Cadez et al. 2003）,DdeI限制性内切酶可以将H. uvarum和H. guilliermondii区分开（Esteve-Zarzoso et al. 2001）,MboII和DdeI都可以区分H. opuntiae和H. uvarum（Wang & Liu 2013）,DraI可以区分H. opuntiae和H. guilliermondii （Seixas et al. 2019）。不依赖于培养的技术近年来也被开发用于检测葡萄酒微生物多样性、葡萄酒特定酵母菌种群落浓度变化等,其中荧光原位杂交技术（FISH）和实时定量PCR技术（qPCR）已被成功应用于分析有孢汉逊酵母属的菌群浓度,但相关研究检测对象无法区分有孢汉逊酵母属内近缘种（Wang et al. 2014;Wang et al. 2015）,此外,不依赖于培养的技术目前尚无法进行有孢汉逊酵母属种内即菌株水平上的差异分析。酵母菌菌株水平上的遗传多样性分析在酿酒酵母中研究较为广泛,应用较多的方法为基于PCR的分子指纹图谱分析方法（Liu et al. 2014）,如Interdelta指纹图谱法和微卫星标记技术（铁春燕等 2014）。分析有孢汉逊酵母属种内差异和遗传多样性的研究相对较少,微卫星引物(ATG)₅、(GTG)₅和(GACA)₄最初用于表征有孢汉逊酵母属近缘种的差异（Cadez et al. 2003）;Esteve-Zarzoso et al.（2010）采用了扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）技术有效展现了H. uvarum和H. vineae van der Walt & Tscheuschner菌株基因型多态性;Barquet et al.（2012）设计了两个微卫星引物通过扩增tRNA基因的串联重复区域[tandem repeat-tRNA（TRtRNA）,指纹图谱法]实现了H. vineae、H. uvarum和H. opuntiae种间和种内差异性分析;Albertin et al.（2016）采用11个微星位点对分离自葡萄酒发酵过程中的115株H. uvarum进行了分子遗传特征分析,其研究结果表明微卫星标记技术和AFLP都可以有效进行H. uvarum菌株水平的差异分析,但进一步的聚类分析表明微卫星标记技术所表征的菌株差异更能体现所分离H. uvarum的时间和空间遗传多样性。

葡萄酒发酵中常见的野生有孢汉逊酵母属酵母菌,具有混合接种发酵的应用潜力,但近缘种的菌种水平和种内水平的分子指纹图谱分析相对较少,尤其是中国本土野生有孢汉逊酵母属酵母的相关分子指纹图谱研究尚未见报道。相关报道表明,在世界各葡萄酒产区中以H. uvarum的分布最为普遍,关于该菌种的分子遗传特征的研究也最多,为有孢汉逊酵母属内其他菌种的研究奠定了基础。中国葡萄酒产区中报道有大量的有孢汉逊酵母属菌种尤其是H. opuntiae存在（Wang & Liu 2013）,对有孢汉逊酵母属的分子指纹图谱分析,一方面为促进近缘种分子研究提供丰富的菌种来源,另一方面也将有利于中国野生酵母资源的开发。

本研究利用WL营养培养基、26S rRNA基因D1/D2区域序列分析和5.8S-ITS-RFLP分析对分离自贵州紫云县刺葡萄自然发酵过程中的 118株野生有孢汉逊酵母属酵母菌进行菌种水平鉴定,并进一步结合TRtRNA指纹图谱法分析近缘种种间和种内差异,构建有孢汉逊酵母属酵母菌的分子指纹图谱,为有孢汉逊酵母属酵母菌在葡萄酒酿造中的应用提供遗传多样性理论参考。

1.1.1 实验菌株：实验菌株包括参考菌株5株（H. opuntiae CECT11027、H. uvarum CBS314、H. vineae CBS6555、H. guilliermondii CBS1972、H. osmophila CBS313,获取自西班牙罗维拉·依维尔基里大学URV实验室菌种库）和2017年贵州紫云县刺葡萄自然发酵过程中分离的118株有孢汉逊酵母属酵母菌（保藏于贵州大学酿酒与食品工程学院贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,Wang et al. 2019）。

1.1.2 实验用培养基及酵母培养方法：YPD培养基：1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖,2%琼脂粉。将保藏的菌液通过划线培养在YPD营养基上,28-30℃培养2d后,用于DNA提取。

1.1.3 WL营养培养基：购于上海博维生物科技有限公司,按照说明配制。将保藏的菌液通过划线培养在WL营养基上,28-30℃培养5d后,观察记录菌落特征。

取培养于YPD培养基2d的菌体适量,采用石英砂破壁法提取DNA（周小玲等 2004）。

1.3 5.8S-ITS-RFLP分析

1.3.1 PCR扩增反应（Wang & Liu 2013）：PCR反应体系：总体积25µL,包含3mmol/L MgCl₂、1× buffer、0.2mmol/L dNTPs、0.2µmol/L ITS1引物和ITS4引物（White et al. 1990）、1.25U TaqDNA聚合酶（TaKaRa,大连）和1µL DNA模板。PCR扩增程序为：预变性95℃ 8min;变性95℃ 30s,退火52℃ 30s,延伸72℃ 1min,40个循环;延伸72℃ 10min。

1.3.2 PCR产物检测：PCR产物通过Genergeen核酸染料[天根生物科技（北京）有限公司,北京]染色的1.5% HyAgarose琼脂糖（厦门太阳马生物工程有限公司,厦门）凝胶电泳进行检测,电泳液为0.5× TBE缓冲液,电泳条件为90V 50min。电泳图谱通过凝胶成像仪（SIM,美国）拍照记录,参考100bp DNA marker（TaKaRa,大连）读取图谱条带。

1.3.3 限制性内切酶酶切反应：酶切反应体系：总体积为20µL,包含1× buffer、1µL限制性核酸内切酶（HaeIII、DdeI和MboII）、7µL双蒸水和10µL PCR扩增产物。酶切反应程序：恒温振荡仪300r/min 37℃反应4h。

1.3.4 酶切产物检测：酶切产物检测如1.3.2所述,分析本土菌株与参考菌株酶切图谱的一致性,每种酶切图谱选择代表性菌株进一步采用26S rRNA基因D1/D2区域序列分析进行鉴定。

1.4 26S rRNA基因D1/D2区域序列分析

1.4.1 PCR扩增反应（Wang & Liu 2013）：PCR反应体系：总体积50µL,包含1.5mmol/L的MgCl₂、1× buffer、0.2mmol/L dNTPs、0.2µmol/L NL1引物和NL4引物（Reynolds & Taylor 1993）、1.5U TaqDNA聚合酶和1µL DNA模板。PCR扩增程序为：预变性95℃ 5min;变性94℃ 1min,退火52℃ 1min,延伸72℃ 90s,36个循环;延伸72℃ 8min。

1.4.2 PCR产物检测与序列分析：PCR产物检测如1.3.2所述,具有单一目的条带的PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司,采用NL1引物测序,测序后去除序列前端10-20bp峰度杂乱的碱基获得质量好的序列,使用BLAST软件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）与有孢汉逊酵母属13个种的模式菌株序列进行比对,以相似性最高的菌种作为本土菌株的菌种名称。本研究代表性本土菌株的GenBank序列号见表1,为证明BLAST比对的准确性,采用MEGA5软件构建代表性本土菌株和模式菌株序列之间的系统发育树,系统发育试验（test of phylogeny）采用引导程序法（bootstrap method）,引导程序重复数量设定为1 000,置换模型设定为Kimula双参数法（Kimura 2-parameter method）。

1.5.1 PCR扩增反应：PCR反应体系：总体积20µL,包含2.5mmol/L MgCl₂、1× buffer、0.2mmol/L dNTPs、1µmol/L TrRNASc引物和5CAG引物（或TrRNASc引物和ISSR-MB引物）、1U TaqDNA聚合酶和1µL DNA模板。TrRNASc引物序列5′-GCTTCT ATGGCCAAGTTG-3′,5CAG引物序列5′-CAGCAGCA GCAGCAG-3′,ISSR-MB引物序列5′-CTCACAACAAC AACAACA-3′（Barquet et al. 2012）。PCR扩增程序为：预变性95℃ 5min;变性95℃ 60s,退火50℃ 60s,延伸72℃ 90s,35个循环;延伸72℃ 10min。

1.5.2 PCR产物检测与分析：PCR产物检测如1.3.2所述,对照100bp和250bp DNA marker读取图谱条带。每种图谱条带按“1”（有）和“0”（无）进行转化,用DPS数据处理系统进行聚类分析,聚类距离采用欧式距离,聚类方法为类平均法（UPGMA法）。

118株有孢汉逊酵母属酵母菌在WL营养培养基上呈现4类菌落特征,共同菌落特征为：扁平圆形,表面光滑不透明,黄油状,菌落颜色呈中央绿色边缘白色。4类菌落特征的主要区别在于菌落颜色差异,即中央绿色部分的深浅和边缘白色部分的宽度：I中央浅绿色至深绿色,边缘白色宽度1mm左右,共71株;II中央深绿色,边缘白色宽度0.2mm,共18株;III中央浅蓝绿色,边缘白色宽度1mm左右,共20株;IV浅绿色,颜色分布均匀,共9株。

依据5.8S-ITS-RFLP分析和26S rRNA基因D1/D2区域序列分析,118株有孢汉逊酵母属酵母菌被鉴定为3个种：H. uvarum、H. opuntiae和H. occidentalis M.Th. Smith（表1,图1）。63株H. uvarum在WL营养培养基上呈现I（42株）、II（15株）和IV（6株）共3类菌落特征,52株H. opuntiae在WL营养培养基上呈现I（26株）、II（3株）、III（20株）和IV（3株）共4类菌落特征,3株H. occidentalis在WL营养培养基上呈现I类菌落特征,因此除III类菌落特征为H. opuntiae所特有之外,其余菌落特征都包含一种以上菌种。

118株有孢汉逊酵母属酵母菌的5.8S rRNA基因在ITS区域的PCR扩增产物大小一致为780bp,HaeIII限制性内切酶可以区分出H. occidentalis,但无法区分其余两个种。MboII和DdeI都可以有效区分H. uvarum和H. opuntiae。 5种已知分类地位的参考菌株的5.8S-ITS-RFLP分析,为本土菌株的种水平鉴定提供了参考依据。

依据WL菌落特征和5.8S-ITS-RFLP分析结果,选择8株代表性本土菌株进行26S rRNA基因D1/D2区域序列分析,通过与13种有孢汉逊酵母模式菌株的同源序列比对,进一步确定了本土菌株的菌种分类地位,即序列相似性最高的菌种（表1,图1）。值得注意的是,本土菌株H. uvarum和H. opuntiae在与7个近缘种有孢汉逊酵母模式菌株的序列比对时,都展现了高于99%的序列相似性：H. uvarum代表性菌株FBKL2.9310（序列登录号MN203647）、FBKL2.9400（序列登录号MN203648）、FBKL2.9617（序列登录号MN203649）、FBKL2.9648（序列登录号MN203650）和FBKL2.9367（序列登录号MK581163）与H. uvarum模式菌株序列相似性最高（99.82%）,其次为H. clermontiae（99.28%）、H. guilliermondii、H. opuntiae、H. pseudoguilliermondii和H. meyeri（98.92%）,与H. lachancei相似性最低（98.76%或98.77%）。类似地,H. opuntiae代表性菌株FBKL2.9288（序列登录号MN203644）和FBKL2.9289（序列登录号MN203645）与H. opuntiae模式菌株序列相似性最高（99.82%）,其次为H. guilliermondii（99.46%）、H. lachancei（99.29%）、H. clermontiae、H. pseudoguilliermondii和H. meyeri（99.10%）,与H. uvarum相似性最低（98.92%）。

TRtRNA指纹图谱分析采用两对微卫星引物对118株有孢汉逊酵母属酵母菌进行种内差异分析。引物对一TtRNASC和5CAG将全部有孢汉逊酵母属酵母菌株分为5类：A1类图谱条带为120+140+ 240+320+380+450+600+800+1 000+1 200+1 800+ 2 500（粗体表示较亮条带）,包含50株H. opuntiae;A2类图谱条带为120+140+380+600+800+2 000,包含2株H. opuntiae;B类图谱条带为100+450+ 800+1 300+1 800,包含1株H. uvarum;C类图谱条带为200+280+320+500+800+1 500+2 500+3 000,包含62株H. uvarum;D类图谱条带为180+280+ 350+400+580+750+900+1 000+1 500,包含3株H. occidentalis。5类图谱条带的聚类分析显示A1、A2、B和C类明显区别于D类,A1类与A2类遗传关系最近（图2）。

引物对二TtRNASC和ISSR-MB将全部有孢汉逊酵母属酵母菌株分为10类：a1类图谱条带为120+260+320+540+700+1 200+1 800+2 000+4 000,包含50株H. opuntiae;a2类图谱条带为120+200+260+320+540+700+1 200,包含2株H. opuntiae;b类图谱条带为140+250+300+400+ 1 000+1 100+1 400+2 500+4 000,包含1株H. uvarum;c1类图谱条带为320+440+540+1 100+ 1 500+2 500+4 000,包含22株H. uvarum;c2类图谱条带为320+500+1 100+1 500+2 500+4 000,包含36株H. uvarum;c3、c4、c5和c6类图谱条带分别为320+500+1 500+2 500+4 000、320+ 440+1 100+1 500+2 500+4 000、130+320+1 100+ 1 500+2 500+4 000和130+320+1 100+1 500,分别包含1株H. uvarum;d类图谱条带为260+320+ 480+650+850+1 000,包含3株H. occidentalis。 10类图谱条带的聚类分析显示c1、c2、c3、c4、c5和c6类遗传关系较近聚为一类,a1和a2类遗传关系较近聚为一类,这两类明显区别于b类与d类,c1与c4、c2与c3遗传关系最近（图3）。

WL营养培养基上呈现的4类菌落特征与TRtRNA指纹图谱分析结果一一比对后发现,I类菌落特征对应除Bb之外的所有图谱条带,II类菌落特征对应A1a1、A1a2、Cc2和Cc1 4类图谱条带,III类菌落特征对应A1a1和A1a2 2类图谱条带,IV类菌落特征对应A1a1、Bb、Cc2和Cc1 4类图谱条带,因此,具有不同WL菌落形态的菌株并不一定具有不同的TRtRNA指纹图谱。

有孢汉逊酵母属是葡萄酒发酵初期存在的主导野生酵母菌属之一。有孢汉逊酵母属内包含13个不同的种（Jindamorakot et al. 2009;Cadez & Smith 2011）,其中葡萄酒发酵中常见的主导野生酵母为葡萄汁有孢汉逊酵母H. uvarum、仙人掌有孢汉逊酵母H. opuntiae和季也蒙有孢汉逊酵母H. guillermondii,在世界各葡萄酒产区中以H. uvarum的分布最为普遍,其余种的分布因产区和葡萄品种而异（Wang & Liu 2013;Albertin et al. 2016;Masneuf-Pomarede et al. 2016）。本研究对118株野生有孢汉逊酵母属酵母菌进行菌种水平鉴定,并进一步利用TRtRNA指纹图谱法构建有孢汉逊酵母属酵母菌的分子指纹图谱,分析近缘种种间和种内差异。研究表明,贵州紫云县刺葡萄自然发酵过程中分离的118株野生有孢汉逊酵母属以H. opuntiae和H. uvarum为主,还包含少量的H. occidentalis。TRtRNA指纹图谱分析进一步揭示H. occidentalis指纹图谱明显不同于其余两个种,验证了该方法对种间差异的表征（Barquet et al. 2012）。H. uvarum表现了丰富的种内差异,主导指纹图谱为C类（引物对一）、c1和c2类（引物对二）,H. opuntiae表现了一定的种内差异,主导指纹图谱为A1类（引物对一）和a1类（引物对二）,验证了该方法对种内差异的表征（Barquet et al. 2012）。

本研究利用依赖于培养的经典方法——WL营养培养基、26S rRNA基因D1/D2区域序列分析和5.8S-ITS-RFLP分析（Wang & Liu 2013）鉴定 118株野生有孢汉逊酵母属酵母菌,研究结果证实3种方法的结合可以有效实现菌种水平的研究。其中,WL营养培养基可以实现属水平的鉴定、种/菌株水平的区分和菌株纯度的确定,但尚无法建立起菌落特征与菌种鉴定之间的关联（Wang & Liu 2013）。本土菌株H. uvarum和H. opuntiae在与7个近缘种有孢汉逊酵母模式菌株的序列比对时,都展现了高于99%的序列相似性,该结论与Cadez et al.（2003）的研究结果一致,即H. uvarum、H. opuntiae、H. guilliermondii、H. clermontiae、H. lachancei、H. pseudoguilliermondii和H. meyeri的26S rRNA基因D1/D2区域序列差异不超过1%。Kurzman & Robnett（1998）表明,当两个序列的26S rRNA基因D1/D2区域序列差异超过1%时分属不同的菌种,因此有孢汉逊酵母属内近缘种的鉴定无法使用该标准,但本研究显示近缘种的序列比对可选择序列相似性最高的菌种作为鉴定结果。此外,H. clermontiae无法在30℃和37℃条件下生长（Cadez et al. 2003;Cadez & Smith 2011）,而本研究所分离酵母菌均采用28-30℃培养条件,因此118株酵母中含有H. clermontiae的几率较低。前人研究（Esteve-Zarzoso et al. 2001; Cadez et al. 2003;Wang & Liu 2013）和5.8S-ITS-RFLP理论分析（软件Primer 5.0）表明限制性内切酶MboII和DdeI可以区分除H. clermontiae之外的6个近缘种,而DraI和HinfI可分别将H. guilliermondii和H. pseudoguilliermondii从7个近缘种中区分出来,因此本研究中选择限制性内切酶MboII和DdeI进行近缘种鉴定。研究表明5.8S-ITS-RFLP分析结合参考菌株的使用可以实现有孢汉逊酵母属近缘种的准确鉴定,MboII和DdeI限制性内切酶对H. opuntiae和H. uvarum的区分能力与前人研究一致,只不过由于电泳条件的不同导致前人研究所示图谱条带与本研究酶切图谱存在差异,进一步说明在该研究方法中使用参考菌株的必要性。当然在利用5.8S-ITS-RFLP分析有孢汉逊酵母属酵母的种水平分类地位时,更多限制性内切酶（如DraI和HinfI）和参考菌株的选用,将更加全面地证实菌种水平尤其是近缘种鉴定的准确性。

本研究首次使用TRtRNA指纹图谱法研究中国本土有孢汉逊酵母属的遗传多样性,结果表明该方法可以体现118株野生有孢汉逊酵母属的种间差异和种内差异,其中63株H. uvarum展现了丰富的种内差异,而52株H. opuntiae的两对微卫星引物指纹图谱展现了一定的种内差异。此结果一方面说明贵州紫云县刺葡萄自然发酵过程中分离的H. uvarum菌株遗传多样性丰富,而其余有孢汉逊酵母属种内菌株遗传多样性相对单一。另一方面TRtRNA指纹图谱法对有孢汉逊酵母属内13个菌种的种内遗传多样性分析的能力需要进一步拓展研究,在拓展研究中需要每个种收集较多的菌株及采用其他技术方法做对比,如AFLP技术（Esteve-Zarzoso et al. 2010）和微卫星标记技术（Albertin et al. 2016）在H. uvarum之外其他种菌株遗传多样性研究中的开发应用。此外,后续研究将进一步关注H. opuntiae、H. uvarum和H. occidentalis种内近缘菌株之间的生理差异和遗传多样性。