菌根食用菌（edible mycorrhizal fungi,EMF）系能形成可食用子实体的外生菌根（ectomycorrhiza,ECM）真菌,其对促进林木生长、提高林木抗逆性和发展林下经济有重要意义（Murat et al. 2008;唐超等 2011）。我国EMF资源十分丰富,在Wu et al.（2019）整理收录的我国食用真菌1 020个分类单元中就有600余个属于EMF。
EMF的腐生能力有限,无法像腐生型食用菌一样进行人工栽培,必须与宿主植物建立菌根共生体后才可进一步形成子实体（Yamada et al. 2001;刘润进和陈应龙 2007;冯云利等 2013）,且其子实体的形成受环境条件的影响较大（Savoie & Largeteau 2011;Collado et al. 2019）。目前,EMF子实体的产出主要靠野生资源（Yamada et al. 2001;唐超等 2011）。作为林木的共生真菌,ECM真菌对宿主有一定的选择性,同时,分布在不同地域的同一树种可能与多种不同的ECM真菌建立共生关系（Smith & Read 2008）。因而要发掘和利用EMF资源,需要针对目标区域的地域特点进行EMF资源调查并阐明EMF子实体的发生规律以便后续筛选适宜于特定地域、特定气候条件、特定树种的具有高经济价值的EMF（Bonet et al. 2004）。
马尾松Pinus massoniana是贵州地区极为重要的造林和用材树种（周政贤 2001）。以往调查发现,马尾松林不但有大量的木材腐朽真菌（Wu et al. 2020）,而且有着丰富的ECM真菌资源,其中不乏鸡油菌Cantharellus cibarius、变绿红菇Russula virescens等具有高经济价值的EMF（陈连庆 1989;张伦等 2009）。这些真菌主要依赖马尾松等宿主林分的自然产出,尚无法实现人工栽培。
目前,贵州地区的EMF研究还停留在粗放的踏查和初步的形态鉴定方面,EMF在马尾松林的多样性、其与马尾松根系的共生特征及子实体的发生规律等还不清楚。为筛选经济价值高、菌根效应显著的马尾松EMF,以及将来按照“适地、适树、适菌”的原则筛选EMF进行林下栽培,迫切需要对马尾松EMF资源进行系统调查,阐明其与马尾松的共生特征和子实体发生规律。
基于此,本研究以黔中地区马尾松林EMF为研究对象,调查马尾松林EMF的多样性、其与马尾松根系的共生特征,在此基础上研究EMF子实体的月际发生规律,以期为后续马尾松林EMF资源的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 样地概况
黔中地区现存马尾松林主要造林于上世纪90年代（林龄主要集中在20-30年之间）,以人工纯林为主,另有部分原马尾松林砍伐后自然更新形成的马尾松天然次生林。基于此,本研究以位于贵州省贵阳市花溪区孟关国有林场和贵州省黔南布依族苗族自治州龙里国有林场的马尾松人工纯林以及位于贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县的马尾松天然次生林为调查样地。样地信息如下：
（1）孟关国有林场马尾松人工纯林（106o44′38″ E,26o21′59″ N）,海拔1 140m,郁闭度0.75,林龄26年,密度799株/hm²。林下土壤为黄壤,pH为4.5,有机质含量为20.15g/kg,总氮含量为1.13g/kg,有效氮含量为98.23mg/kg,总磷含量为0.20g/kg,有效磷含量为1.11mg/kg,有效钾含量为68.95mg/kg。
（2）龙里国有林场马尾松人工纯林（107o00′22″ E,26o27′58″ N）,海拔1 050m,郁闭度0.75,林龄20年,密度832株/hm²。林下土壤为黄壤,pH为4.4,有机质含量为19.76g/kg,总氮含量为0.89g/kg,有效氮含量为62.20mg/kg,总磷含量为0.15g/kg,有效磷含量为0.86mg/kg,有效钾含量为62.75mg/kg。
（3）龙里县天然次生林（107o35′04″ E,26o10′39″ N）,海拔853m,郁闭度0.7,林龄24年,密度744株/hm²。林下土壤为黄壤,pH为4.7,有机质含量为18.35g/kg,总氮含量为0.85g/kg,有效氮含量为72.2mg/kg,总磷含量为0.18g/kg,有效磷含量为0.87mg/kg,有效钾含量为77.61mg/kg。
3个样地均处于亚热带季风气候区,年平均降水量1 100-1 400mm,年平均气温14.4-14.9℃。
1.2 马尾松林EMF多样性调查
1.2.1 踏查法：于2016年5-11月开展马尾松林EMF多样性调查。采用踏查法在样地内随机采集真菌子实体,直至无新物种发现,记录子实体的大小、颜色、菌褶或菌孔着生方式等宏观特征。根据已有文献资料和子实体的生态习性初步判断子实体是否为ECM真菌。对于不确定的物种,需沿子实体基部菌索或菌丝束进行追踪调查（即从子实体的基部小心挖掘找到菌索或菌丝束,并沿着菌索或菌丝束追踪直到发现与其共生的马尾松根系）,以确认该真菌子实体为ECM真菌。将带回实验室的新鲜子实体分别于体视显微镜（M205FA,Leica）和复式显微镜（DM3000,Leica）下观察其微观结构（撕片或徒手切片后观察菌肉菌丝结构、孢子、担子、囊状体等）。
1.2.2 孢子的扫描电镜观测：用细毛刷蘸取孢子[来自孢子印（伞菌）或直接从子实层蘸取（非伞菌）]转移至粘贴在样品台上的导电胶带上,在离子溅射仪（MSP-mini,IXRF Systema,Inc）上镀金1min,随后进行扫描电镜（TM4000 plus,日立）观测,观测条件为：电压：15kV,真空度：高真空,电子检测模式：BSE。
1.3 ECM形态特征研究
在采集EMF子实体的同时,沿子实体基部的菌索或菌丝束追踪与之相连的马尾松根系,小心采集末级细根。将采集到的马尾松根系带回实验室,浸泡在清水中,用镊子、解剖针或软毛刷小心除去附于根系上的泥土及枯落物等杂质,挑选菌根化的根尖于体视显微镜（M205FA,Leica）下观察菌根的形状、颜色、分枝情况及附属物（根外菌丝或菌索）。ECM形态特征描述及探索类型划分参照Agerer（1987-2012,1991,2001）的报道。
1.4 EMF子实体及ECM的分子生物学鉴定
子实体及ECM的分子鉴定同冯万艳等（2019）的方法。DNA提取采用CTAB法,采用引物对ITS1/ITS4（White et al. 1990）扩增ITS序列,PCR产物纯化后交由上海生工生物工程公司进行测序。仅当菌根测得的ITS序列与子实体序列一致才认为该菌根由对应EMF与马尾松根系形成。将测得的ITS序列进行Blast比对并上传至GenBank,获取序列登录号。分别为：隐花青鹅膏Amanita manginiana（MT560336）、冠锁瑚菌Clavulina coralloides（MT560346）、紫蜡蘑Laccaria amethystine（MT613702）、红蜡蘑L. laccata（MT555321）、美丽褶孔牛肝菌Phylloporus bellus（MT568574）、混淆松塔牛肝菌Strobilomyces confusus（MT622851）、松塔牛肝菌Str. strobilaceus（MT568581）、玫红铆钉菇Gomphidius roseus（MT560350）、多根硬皮马勃Scleroderma polyrhizum（MT588797）、粘盖乳牛肝菌Suillus bovinus（MK239980）、褐环乳牛肝菌S. leteus（MK418873）、鸡油菌Cantharellus cibarius（MT566420）、卷缘齿菌Hydnum repandum（MT560353）、黄汁乳菇Lactarius chrysorrheus（MT560360）、红汁乳菇L. hatsudake（MT555410）、鲜艳乳菇L. vividus（MT568545）、多汁乳菇L. volemus（MT555413）、红色红菇Russula rosea（MT555414）、血红菇R. sanguinea（MT588796）、变绿红菇R. virescens（MT568575）。
1.5 马尾松林EMF子实体月际发生规律调查
因本研究发现的EMF在龙里林场马尾松人工纯林均有分布,且该样地地处偏僻,人为干扰相对较少,故后续子实体月际发生规律调查在该样地开展。调查方法同冯万艳等（2019）的报道,调查周期为4年（2016年1月至2019年12月）。同时,从国家气象科学数据中心（
因样地周围群众有采食野生食用菌的习惯,具体EMF物种子实体的产量难以估计,调查结果仅列出子实体发生与否。
1.6 数据处理
采用SPSS 19.0.0进行数据统计分析。对EMF子实体发生种类与气象要素的关系进行Spearman相关系数分析。
2 结果与分析
2.1 马尾松林EMF多样性
表1 马尾松林菌根食用菌汇总及其食用性记录
Table 1
| 种名 Species | 分类地位 Taxonomic position | 可食用记录 Records of edibility | ||
|---|---|---|---|---|
| 隐花青鹅膏1 Amanita manginiana sensu WF Chiu | 伞菌目 Agaricales | 鹅膏科 Amanitaceae | 鹅膏属 Amanita | Dai et al. 2010; Li et al. 2015; Yang 2015 |
| 冠锁瑚菌 Clavulina coralloides (L.) J. Schröt. | 伞菌目 Agaricales | 珊瑚菌科 Clavariaceae | 锁瑚菌属 Clavulina | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 紫蜡蘑 Laccaria amethystina Cooke | 伞菌目 Agaricales | 轴腹菌科 Hydnangiaceae | 蜡蘑属 Laccaria | Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 红蜡蘑 Laccaria laccata (Scop.) Cooke | 伞菌目 Agaricales | 轴腹菌科 Hydnangiaceae | 蜡蘑属 Laccaria | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 美丽褶孔牛肝菌 Phylloporus bellus (Massee) Corner | 牛肝菌目 Boletales | 牛肝菌科 Boletaceae | 褶孔牛肝菌属 Phylloporus | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 混淆松塔牛肝菌 Strobilomyces confusus Singer | 牛肝菌目 Boletales | 牛肝菌科 Boletaceae | 松塔牛肝菌属 Strobilomyces | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010 |
| 松塔牛肝菌 Strobilomyces strobilaceus (Scop.) Berk. | 牛肝菌目 Boletales | 牛肝菌科 Boletaceae | 松塔牛肝菌属 Strobilomyces | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 玫红铆钉菇 Gomphidius roseus (Fr.) Fr. | 牛肝菌目 Boletales | 铆钉菇科 Gomphidiaceae | 铆钉菇属 Gomphidius | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Wu et al. 2014 |
| 多根硬皮马勃2 Scleroderma polyrhizum (J.F. Gmel.) Pers. | 牛肝菌目 Boletales | 硬皮马勃科 Sclerodermataceae | 硬皮马勃属 Scleroderma | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Wu et al. 2014 |
| 粘盖乳牛肝菌3 Suillus bovinus (L.: Fr.) Kuntze | 牛肝菌目 Boletales | 乳牛肝菌科 Suillaceae | 乳牛肝菌属 Suillus | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 褐环乳牛肝菌3 Suillus leteus (L.) Roussel | 牛肝菌目 Boletales | 乳牛肝菌科 Suillaceae | 乳牛肝菌属 Suillus | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Chen & Zhang 2019 |
| 鸡油菌 Cantharellus cibarius Fr. | 鸡油菌目 Cantharellales | 鸡油菌科 Cantharellaceae | 鸡油菌属 Cantharellus | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Wu et al. 2014; Li et al. 2015 |
| 卷缘齿菌 Hydnum repandum L. | 鸡油菌目 Cantharellales | 齿菌科 Hydnaceae | 齿菌属 Hydnum | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 黄汁乳菇4 Lactarius chrysorrheus Fr. | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 乳菇属 Lactarius | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Chen & Zhang 2019 |
| 红汁乳菇 Lactarius hatsudake Nobuj. Tanaka | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 乳菇属 Lactarius | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 鲜艳乳菇 Lactarius vividus X.H. Wang et al. | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 乳菇属 Lactarius | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Chen & Zhang 2019 |
| 多汁乳菇 Lactifluus volemus (Fr.) Kuntze | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 多汁乳菇属 Lactifluus | Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 红色红菇 Russula rosea Pers. | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 红菇属 Russula | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Chen & Zhang 2019 |
| 血红菇 Russula sanguinea (Bull.) Fr. | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 红菇属 Russula | Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
| 变绿红菇 Russula virescens (Schaeff.) Fr. | 红菇目 Russulales | 红菇科 Russulaceae | 红菇属 Russula | Wu et al. 2019; Dai et al. 2010; Li et al. 2015 |
注：1宜大量开水煮后烹饪;2幼时可食;3宜去除菌盖皮后食用;4可能引发肠胃不适
Note: 1 Ought to boil with plenty of water before cooking; 2 edible when young; 3 eatable after removing the pileipellis; 4 probably causing gastrointestinal discomfort.
图1
图1
马尾松林EMF子实体形态特征 A-T：隐花青鹅膏、冠锁瑚菌、紫蜡蘑、红蜡蘑、美丽褶孔牛肝菌、混淆松塔牛肝菌、松塔牛肝菌、玫红铆钉菇、多根硬皮马勃、粘盖乳牛肝菌、褐环乳牛肝菌、鸡油菌、卷缘齿菌、黄汁乳菇、红汁乳菇、鲜艳乳菇、多汁乳菇、红色红菇、血红菇、变绿红菇
Fig. 1
Sporocarps of EMF in Pinus massoniana forests. A to T: Amanita manginiana, Clavulina coralloides, Laccaria amethystine, Lac. laccata, Phylloporus bellus, Strobilomyces confuses, Str. strobilaceus, Gomphidius roseus, Scleroderma polyrhizum, Suillus bovinus, S. leteus, Cantharellus cibarius, Hydnum repandum, Lactarius chrysorrheus, L. hatsudake, L. vividus, Lactifluus volemus, Russula rosea, R. sanguinea, and R. virescens.
不同EMF子实体形态各异,其担孢子也有明显的形态差异（图1、图2）。鹅膏属Amanita真菌担孢子近球形,表面光滑;锁瑚菌属Clavulina真菌担孢子近球形至宽椭圆形,表面光滑;蜡蘑属Laccaria真菌担孢子近球形或短椭圆形,表面有小刺或小疣;褶孔牛肝菌属Phylloporus真菌担孢子长椭圆形,表面光滑;松塔牛肝菌属Strobilomyces真菌担孢子卵圆形,表面具网纹;铆钉菇属Gomphidius真菌担孢子纺锤形,表面光滑;硬皮马勃属Scleroderma真菌担孢子球形,表面具不完全网纹;乳牛肝菌属Suillus真菌担孢子长椭圆形,表面光滑;鸡油菌属Cantharellus真菌担孢子宽椭圆形,表面光滑;齿菌属Hydnum真菌担孢子宽椭球型,表面光滑;乳菇属Lactarius真菌担孢子球形,具脊状纹饰形成的完全或不完全网纹;多汁乳菇属Lactifluus真菌担孢子球形或宽椭球型,具脊状纹饰或小疣突;红菇属Russula真菌担孢子近球形,具疣突。
图2
图2
EMF孢子形态特征 A-T：隐花青鹅膏、冠锁瑚菌、紫蜡蘑、红蜡蘑、美丽褶孔牛肝菌、混淆松塔牛肝菌、松塔牛肝菌、玫红铆钉菇、多根硬皮马勃、粘盖乳牛肝菌、褐环乳牛肝菌、鸡油菌、卷缘齿菌、黄汁乳菇、红汁乳菇、鲜艳乳菇、多汁乳菇、红色红菇、血红菇、变绿红菇. 标尺=10μm
Fig. 2
Morphological characteristics of EMF spores. A to T: Amanita manginiana, Clavulina coralloides, Laccaria amethystine, Lac. laccata, Phylloporus bellus, Strobilomyces confuses, Str. strobilaceus, Gomphidius roseus, Scleroderma polyrhizum, Suillus bovinus, S. leteus, Cantharellus cibarius, Hydnum repandum, Lactarius chrysorrheus, L. hatsudake, L. vividus, Lactifluus volemus, Russula rosea, R. sanguinea, and R. virescens. Scale bars=10μm.
2.2 EMF与马尾松形成的菌根特征
图3
图3
EMF与马尾松根系形成的外生菌根特征 A-T：隐花青鹅膏、冠锁瑚菌、紫蜡蘑、红蜡蘑、美丽褶孔牛肝菌、混淆松塔牛肝菌、松塔牛肝菌、玫红铆钉菇、多根硬皮马勃、粘盖乳牛肝菌、褐环乳牛肝菌、鸡油菌、卷缘齿菌、黄汁乳菇、红汁乳菇、鲜艳乳菇、多汁乳菇、红色红菇、血红菇、变绿红菇. 标尺=1mm
Fig. 3
Morphological characteristics of ECM formed by Pinus massoniana root and EMF. A to T: Amanita manginiana, Clavulina coralloides, Laccaria amethystine, Lac. laccata, Phylloporus bellus, Strobilomyces confuses, Str. strobilaceus, Gomphidius roseus, Scleroderma polyrhizum, Suillus bovinus, S. leteus, Cantharellus cibarius, Hydnum repandum, Lactarius chrysorrheus, L. hatsudake, L. vividus, Lactifluus volemus, Russula rosea, R. sanguinea, and R. virescens. Scale bars=1mm.
表2 菌根食用菌与马尾松形成的ECM类型
Table 2
| 菌根食用菌 EMF | 菌根形态 Morphological type of ECM | 菌根探索类型 Exploration type of ECM |
|---|---|---|
| 隐花青鹅膏 Amanita manginiana | 二叉分枝 Dichotomous | 短距离探索型 Short-distance exploration |
| 冠锁瑚菌 Clavulina coralloides | 珊瑚状 Coralloid | 长距离探索型 Long-distance exploration |
| 紫蜡蘑 Laccaria amethystina | 二叉分枝 Dichotomous | 接触探索型 Contact exploration |
| 红蜡蘑 Lac. laccata | 不规则单轴羽状 Irregularly pinnate, dichotomous-like | 接触探索型 Contact exploration |
| 美丽褶孔牛肝菌 Phylloporus bellus | 二叉分枝 Dichotomous | 接触探索型 Contact exploration |
| 混淆松塔牛肝菌 Strobilomyces confusus | 珊瑚状 Coralloid | 中等距离探索型 Medium-distance exploration |
| 松塔牛肝菌 Str. strobilaceus | 单轴塔状 Monopodial-pyramidal | 长距离探索型 Long-distance exploration |
| 玫红铆钉菇 Gomphidius roseus | 二叉分枝 Dichotomous | 接触探索型 Contact exploration |
| 多根硬皮马勃 Scleroderma polyrhizum | 珊瑚状 Coralloid | 短距离探索型 Short-distance exploration |
| 粘盖乳牛肝菌 Suillus bovinus | 珊瑚状或二叉分枝 Coralloid or dichotomous | 长距离探索型 Long-distance exploration |
| 褐环乳牛肝菌 S. leteus | 珊瑚状 Coralloid | 短距离探索型 Short-distance exploration |
| 鸡油菌 Cantharellus cibarius | 棒状 Clublike | 接触探索型 Contact exploration |
| 卷缘齿菌 Hydnum repandum | 单轴羽状 Irregularly pinnate, dichotomous-like | 中等距离探索型 Medium-distance exploration |
| 黄汁乳菇 Lactarius chrysorrheus | 珊瑚状 Coralloid | 长距离探索型 Long-distance exploration |
| 红汁乳菇 L. hatsudake | 单轴塔状 Monopodial-pyramidal | 短距离探索型 Short-distance exploration |
| 鲜艳乳菇 L. vividus | 珊瑚状 Coralloid | 中等距离探索型 Medium-distance exploration |
| 多汁乳菇 Lactifluus volemus | 棒状或二叉分枝 Clublike or dichotomous | 长距离探索型 Long-distance exploration |
| 红色红菇 Russula rosea | 珊瑚状 Coralloid | 接触探索型 Contact exploration |
| 血红菇 R. sanguinea | 单轴羽状 Irregularly pinnate, dichotomous-like | 短距离探索型 Short-distance exploration |
| 变绿红菇 R. virescens | 二叉分枝 Dichotomous | 短距离探索型 Short-distance exploration |
2.3 菌根食用菌子实体月际发生规律
不同EMF子实体的月际发生规律差异显著（表3）,整体来看6-10月是黔中地区马尾松林EMF子实体的高发期。粘盖乳牛肝菌和褐环乳牛肝菌的发生周期最长,每年持续发生11个月,属于马尾松林的优势EMF。发生周期较长的还有玫红铆钉菇（每年7个月）、冠锁瑚菌（每年6个月）、多根硬皮马勃（每年6个月）、鲜艳乳菇（每年6个月）、多汁乳菇（每年6个月）和红色红菇（每年6个月）。紫蜡蘑和变绿红菇发生周期最短,每年仅有3个月发生。
表3 2016-2019年马尾松林EMF子实体月际发生情况
Table 3
| 菌根食用菌 EMF | 月份Month | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 隐花青鹅膏 Amanita manginiana | - | - | - | - | - | + | + | + | + | - | - | - |
| 冠锁瑚菌 Clavulina coralloides | - | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | - |
| 紫蜡蘑 Laccaria amethystina | - | - | - | - | - | + | + | - | + | - | - | - |
| 红蜡蘑 Lac. laccata | - | - | - | - | - | + | + | - | + | + | - | - |
| 美丽褶孔牛肝菌 Phylloporus bellus | - | - | - | - | + | + | - | + | + | + | - | - |
| 混淆松塔牛肝菌 Strobilomyces confusus | - | - | - | - | + | + | + | + | + | - | - | - |
| 松塔牛肝菌 Str. strobilaceus | - | - | - | - | - | + | + | + | + | - | - | - |
| 玫红铆钉菇 Gomphidius roseus | - | - | - | + | + | + | + | - | + | + | + | - |
| 多根硬皮马勃 Scleroderma polyrhizum | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | - | - |
| 粘盖乳牛肝菌 Suillus bovinus | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 褐环乳牛肝菌 S. leteus | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 鸡油菌 Cantharellus cibarius | - | - | - | - | - | + | + | + | + | - | - | - |
| 卷缘齿菌 Hydnum repandum | - | - | - | - | - | + | + | - | - | + | + | - |
| 黄汁乳菇 Lactarius chrysorrheus | - | - | - | - | - | + | - | - | - | + | + | - |
| 红汁乳菇 L. hatsudake | - | - | - | - | - | + | + | - | + | + | + | - |
| 鲜艳乳菇 L. vividus | - | - | - | - | + | + | + | - | + | + | + | - |
| 多汁乳菇 Lactifluus volemus | - | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | - |
| 红色红菇 Russula rosea | - | - | - | - | + | + | + | - | + | + | + | - |
| 血红菇 R. sanguinea | - | - | - | - | - | + | + | + | + | - | - | - |
| 变绿红菇 R. virescens | - | - | - | - | + | + | + | - | - | - | - | - |
注：“+”代表有子实体发生,“-”代表无子实体发生
Note: “+” Indicates sporocarp present, and “-” indicates sporocarp absent.
不同月份EMF子实体发生种类差异显著（图4）。整体来看,一年中EMF子实体月际发生种类有两个峰值,分别是6月份的20种和9月份的17种。值得注意的是,8月份EMF子实体发生种数相较于7月份和9月份大幅减少（仅11种）。另外,1月份没有EMF子实体发生,2月份、3月份以及12月份仅有两种乳牛肝菌Suillus发生。
图4
图4
马尾松林EMF子实体月际物种发生数
Fig. 4
Number of monthly fruiting EMF species in forests of Pinus massoniana.
表4 EMF子实体发生物种数与温度和降雨量的相关分析
Table 4
| 数量 Number | 降雨量 Precipitation | 平均气温 Mean temperature | 最高气温 Maximum temperature | 最低气温 Minumum temperature | |
|---|---|---|---|---|---|
| EMF子实体发生物种数 Number of fruiting EMF species | 相关系数 Correlation | 0.745** | 0.824** | 0.796** | 0.845** |
| 显著性 Significance | 0.005 | 0.001 | 0.002 | 0.001 | |
注：**表示在置信度为0.01时,相关性显著
Note: ** Indicates correlation is significant at 0.01 level.
图5
图5
马尾松林EMF子实体发生期月均温度和月均降雨情况
Fig. 5
Monthly mean temperature and precipitation during EMF fruiting period in Pinus massoniana forest.
3 讨论
本研究结合形态学和分子生物学方法在黔中地区马尾松林中共发现EMF 20种,从物种组成来看,与以往研究有所差异（陈连庆 1989;张伦等 2009）。以往研究中EMF的鉴定主要基于形态学特征,由于子实体形态特征受环境影响较大,鉴定结果准确性较低。另外,近些年随着分子生物学的发展,相关技术被引入到菌物研究领域,菌物分类发生了较大改变,以往一些分类单元已合并（同物异名）、更名（划分为新的分类单元）或不复存在（无效名称或不合法名称）（李国杰等 2015）。本研究并未在马尾松林发现前人报道的松乳菇L. delicious、美味牛肝菌Boletus edulis等著名EMF（陈连庆 1989;张伦等 2009）,事实上,之前被广泛认定为松乳菇的子实体可能是鲜艳乳菇（Wang et al. 2015）,而美味牛肝菌则可能在中国南方地区没有分布（Cui et al. 2016）。
本研究在调查EMF子实体发生情况的同时采集并观测了马尾松与EMF形成的菌根,这对于后续衡量菌根化育苗效果及在非子实体发生期进行通过采集菌根研究EMF多样性有一定指导意义（Sun et al. 2019）。除粘盖乳牛肝菌和褐环乳牛肝菌外[已在前期研究冯万艳等（2019）中报道],本研究首次报道了18种EMF与马尾松形成的菌根形态及其探索类型。特定ECM真菌与宿主的组合所形成的菌根形态往往存在差异（Agerer 1987-2012,1991）。本研究同样发现,不同EMF与马尾松形成的菌根形态各异,即使是同属EMF与马尾松形成的菌根形态也可能存在差异。整体来看,EMF与马尾松根系形成的菌根其探索类型多样,涵盖接触探索型、短距离探索型、中等距离探索型、长距离探索型等多种类型,表明这些EMF在促进马尾松吸收水分和矿质营养方面可能存在互补性。菌根形态与菌根探索类型无直接对应关系,如二叉分枝状菌根可形成接触探索型、短距离探索型和长距离探索型等多种类型。另外,值得注意的是,ECM的形态有一定的环境可塑性,同时,同种ECM在不同发育阶段其形态也可能存在差异（冯万艳等 2019）。因而,ECM的形态特征仅可作为判定特定EMF存在与否的辅助证据。
有研究表明,EMF子实体的发生与气象要素关系密切（Bonet et al. 2012;Alday et al. 2017;Karavani et al. 2018;Collado et al. 2019）,本研究同样发现,温度和降雨极显著影响EMF子实体的发生种类。不同EMF子实体发生对温度和降雨的需求不同,这与Martínez de Aragón et al.（2007）的研究结论一致。尽管如此,整体来看,20种EMF子实体的发生主要集中在温暖湿润的月份（月均温度15-25℃,月降雨量50-150mm）。Karavani et al.（2018）在对西班牙海岸松Pinus pinaster林大型真菌子实体发生规律的调查中也得出了类似结论。在温度和降雨的综合影响下,每年的6-10月是黔中地区马尾松林EMF子实体的高发期,这与陈连庆（1989）的结论一致。8月份EMF子实体发生物种数相较于7月份和9月份大幅减少,很可能本研究发现的部分EMF子实体是温敏型的,高温限制了这些EMF子实体的发生（Wilkins & Harris 1946;Straatsma et al. 2001）。
尽管本研究发现了20种EMF,但当地群众普遍采食的仅粘盖乳牛肝菌、鲜艳乳菇、冠锁瑚菌、多汁乳菇、鸡油菌、变绿红菇等少数几种。未来有必要对马尾松林EMF进行科普推广,提高群众对EMF的认知。综合发生周期、相对产量（参照市场上的售卖量）、经济价值和市场认可度来看,粘盖乳牛肝菌、褐环乳牛肝菌、鲜艳乳菇、多汁乳菇和红色红菇在黔中地区马尾松林有较好的开发利用前景。玫红铆钉菇（每年7个月）、冠锁瑚菌（每年6个月）和多根硬皮马勃（每年6个月）虽有较长的发生周期,但因玫红铆钉菇和冠锁瑚菌子实体较小、产量较低,多根硬皮马勃仅在幼嫩时可食用且难以从外观判断其成熟度,以上几种EMF并不适宜作为重点开发对象。另外,鸡油菌和变绿红菇虽然发生周期较短,但其市场认可度和经济价值很高,同样值得开发利用。
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