白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究

杨娟; 邹亚杰; 张瑞颖; 胡清秀

doi:10.13346/j.mycosystema.140057

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菌物学报 ›› 2015, Vol. 34 ›› Issue (3) : 456-464. DOI: 10.13346/j.mycosystema.140057 CSTR: 32115.14.j.mycosystema.140057

白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究

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Purification and property of laccase from Pleurotus eryngii var. tuoliensis

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摘要

为了探索白灵侧耳Pleurotus eryngii var. tuoliensis漆酶性质,以白灵侧耳菌株00485为试验材料,从发酵液中分离纯化得到胞外漆酶并对其酶学性质进行测定。纯化流程依次为DEAE-Cellulose阴离子交换层析,CM-Cellulose阳离子交换层析,SP-Sepharose强阳离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤层析,获得胞外白灵侧耳漆酶（PnLac）。SDS-PAGE检测结果表明PnLac为65kDa的单一蛋白。PnLac经过胰蛋白酶水解得到3种肽段,经过NBCI-BLAST后发现它们与糙皮侧耳、环柄韧伞、刺芹侧耳等的漆酶具有同源性。底物为2,2ʹ-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）时该种漆酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3.0,Ca²⁺和Hg²⁺能够抑制它的活性,相反地Cu²⁺和Mn²⁺能够提高它的活性,米氏常数K_m和V_max分别是0.17mmol/L和1.76OD/min/U。

Abstract

An extracellular laccase from the culture broth of Pleurotus eryngii var. tuoliensis 00485 mycelia was isolated and its characterization was determined. The purification procedure was involved in exchange chromatography on DEAE-cellulose, CM-cellulose, and SP-Sepharose, and gel filtration on Superdex 75. The laccase was designed as PnLac. SDS-PAGE detection showed PnLac was a monmeric protein of 65kDa. Three amino acid sequences were obtained after tryptic digestion of PnLac, and they exhibited some similarity to those of laccases from the mushrooms Pleurotus ostreatus, Lentinus sajur-caju and Pleurotus eryngii by NBCI-BLAST. Its optimum pH and temperature were 3.0 and 50°C for ABTS [2,2´-azinzo-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt], respectively. The laccase activity was inhibited by Ca²⁺ and Hg²⁺ while increased by Cu²⁺ and Mn²⁺. The K_m and V_max values of PnLac was 0.17mmol/L and 1.76OD/min/U, respectively.

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杨娟, 邹亚杰, 张瑞颖, 胡清秀. 白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究[J]. 菌物学报, 2015, 34(3): 456-464 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.140057

YANG Juan, ZOU Ya-Jie, ZHANG Rui-Ying, HU Qing-Xiu. Purification and property of laccase from Pleurotus eryngii var. tuoliensis[J]. Mycosystema, 2015, 34(3): 456-464 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.140057

中国多孔菌资源十分丰富,到2009年已发现多孔菌604种（戴玉成 2009）,其中栓孔菌是重要的生物资源（边禄森和戴玉成 2015;崔宝凯和余长军 2011;戴玉成和杨祝良 2008）,同时也是真菌漆酶和生物降解等方向研究的热点（王伟等 2011;司静等 2011a,2011b,2012;司静和崔宝凯 2012）。东方栓孔菌Trametes orientalis (Yasuda) Imaz.,又称灰带栓菌、东方云芝,隶属于菌物界Fungi,担子菌门Basidiomycota,伞菌纲Agaricomycetes,多孔菌目Polyporales,多孔菌科Polyporaceae,栓孔菌属Trametes（戴玉成 2009）。其子实体大,木栓质,无柄侧生,多覆瓦状叠生;菌盖半圆形扁平或近贝壳状,3-12×4-20cm,厚3-10mm,表面具微细绒毛,后渐光滑,米黄色、灰褐色至红褐色,常有同心环棱和放射状皱纹,常具褐色小疣突,盖边缘锐或钝,全缘或波状;菌肉白色,坚韧,厚2-6mm;孢子无色,光滑,长椭圆形,稍弯曲,具小尖,5.5-8×2.5-3μm;菌丝少分枝,无横隔或锁状联合（李海蛟 2013）。该菌广泛分布于我国安徽、北京、福建、广东、海南、湖南、江西、四川、台湾、云南、浙江等地,主要寄主为多种阔叶树的倒木、腐朽木和树桩（戴玉成 2009;Cui et al. 2010;Li et al. 2010）。作为一种常见的白腐真菌,前期研究已发现东方栓孔菌的产漆酶能力较高,且对染料也有较好的脱色效果（司静等 2011a,2011b）。

漆酶（laccase,ρ-diphenol oxidase,EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶,能够催化氧化包括愈创木酚、丁香醛连氮、苯胺、阿魏酸、没食子酸、抗坏血酸（ascorbic acid,AA）和2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）[2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid),ABTS]等在内的多种酚类和非酚类物质（Li et al. 2009;Wong et al. 2012）。漆酶最早是由日本学者Yoshida于1883年首次从漆树的分泌物中发现的,随后科学家们发现一些高等真菌也能分泌漆酶,因其具有降解木质素、可与有毒的酚类物质反应、使石油工业废水去除毒性等作用,近年来在制浆造纸、环境保护、生物合成、食品加工、能源开发等领域得到了广泛的研究与应用（Mayer & Staples 2002;Widsten & Kandelbauer 2008;Kaushik & Malik 2009;Cañas & Camarero 2010;Polak & Jarosz-Wilkolazka 2012;Wan & Li 2012;Rivera-Hoyos et al. 2013;Si et al. 2013）。相关研究还发现,提高分子氧的传递速率可显著促进真菌对于漆酶的分泌,这说明漆酶的合成与真菌自身的抗氧化能力密切相关（Rodríguez Couto & Toca Herrera 2006）。

抗氧化能力是指对机体内氧化物质的清除能力,而机体中有氧化作用的物质主要有超氧阴离子、羟自由基及过氧化氢（H₂O₂）等,由于其性质较不稳定,极易攻击机体内细胞和体液中的生物大分子如DNA、脂类和蛋白质等（Limón-Pacheco & Gonsebatt 2009;曹春蕾等 2013;Zhang et al. 2015）。在正常生理条件下,有机体内的氧化物质处于一种不断产生又不断被抗氧化系统清除的动态平衡状态,甚至低浓度的氧化物质具有一定的杀菌、解毒、参与胞内信号转导、诱导基因活性、刺激细胞生长、分裂和凋亡等多种生理作用。但当机体内的氧化物质过量,打破了产生和消除的平衡体系,就会造成氧化胁迫,进而导致细胞损伤和凋亡（Oberley 1988）。机体清除氧化物质的系统分为酶促和非酶促两类,其中,酶促清除系统包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、抗坏血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase,APX）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）、脱氢抗坏血酸酶（dehydrogenation ascorbic acid enzymes,DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase,MDHAR）等;非酶促清除系统包括多酚、AA、谷胱甘肽（glutathione）、甘露醇（mannitol）、脯氨酸（proline）、山梨醇（sorbitol）和类黄酮（flavonoid）等（刘家忠和龚明 1999;Espinosa-Diez et al. 2015）。

液体发酵作为现代发酵工程的产物,具有生产周期短、不受季节气候限制、产物产量高和易于控制等优点,可作为获得野生真菌大量培养物的可靠途径（杜德清等 2003;余海尤等 2014）。而液体发酵过程中生物量、还原糖含量及分泌酶活性等指标的变化又与菌体自身的生长情况存在一定的相关性（Park et al. 2004;Oroian & Escriche 2015;Aslani & Ghobadi 2016）。因此,本研究采用两种培养基对东方栓孔菌进行液体培养,测定了其在产漆酶过程中相关生理学指标的变化,并对所得数据进行分析,以探讨液体培养过程中真菌漆酶合成、菌株生长和抗氧化能力的相互关系,从而为进一步提高东方栓孔菌的产漆酶能力、缩短培养周期提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和试剂

1.1.1 菌株：东方栓孔菌Trametes orientalis Cui 6300,采集于中国海南省儋州市的金合欢树Acacia farnesiana树桩上,经子实体分离纯化获得,现保藏于北京林业大学微生物研究所。

1.1.2 试剂：ABTS、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）和2,6-二硝基水杨酸（2,6-dinitrosalicylic acid,DNS）购自Sigma;丙二醛（malonaldehyde,MDA）测定试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）测定试剂盒、SOD测定试剂盒、CAT测定试剂盒、H₂O₂测定试剂盒、AA测定试剂盒和抑制羟自由基能力（restraining ability to hydroxyl free radicals,RAHFR）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;其他试剂均为分析纯。

1.2 培养基

1.2.1 固体培养基（g/L）：酵母浸粉5,葡萄糖20,琼脂20,KH₂PO₄ 1,MgSO₄·7H₂O 0.5,ZnSO₄·7H₂O 0.05,维生素B1 0.01,pH自然,1×10⁵Pa灭菌30min。

1.2.2 液体培养基Ⅰ（g/L）：酵母浸粉5,葡萄糖20,KH₂PO₄ 1,MgSO₄·7H₂O 0.5,ZnSO₄·7H₂O 0.05,维生素B1 0.01,pH自然,1×10⁵Pa灭菌30min。

1.2.3 液体培养基Ⅱ（g/L）：麦芽糖10,KH₂PO₄ 1,pH自然,1×10⁵Pa灭菌30min。

1.3 活化及培养

菌株在固体培养基上每月转接一次,于4℃下保藏。使用之前需接种在新制备的固体培养基上进行活化,28℃恒温培养箱内培养7d备用。

1.4 种子发酵

取250mL三角瓶分装100mL液体培养基,尽量从菌丝外围取5个直径约为1cm的菌饼接种至其中,置于28℃、150r/min的摇床中培养。7d后,利用内切式匀浆机以5 000r/min、30s将种子发酵液充分匀浆制成菌悬液,充分振荡,以10%（V/V）的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中,于摇床28℃、150r/min振荡培养,设3个平行。

1.5 样品制备

每2d取样,将整瓶培养物抽滤,所得菌丝球经去离子水冲洗数次,于烘箱65℃烘干至恒重后称重,计算菌丝体生物量。所得发酵液经12 000r/min离心20min,上清液用于测定漆酶活性、还原糖含量、多酚含量、MDA含量、T-AOC、SOD活性、CAT活性、H₂O₂水平、AA含量、RAHFR和DPPH自由基清除能力。

1.6 漆酶活性测定

3.0mL反应体系中,含1.95mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.0）、50.0μL粗酶液和1.0mL 1.0mmol/L ABTS,25℃反应3min后,于420nm处测定吸光值,以去离子水替代酶液同体积的反应混合液为对照。定义1min内催化氧化1μmol ABTS所需的酶量为 1个酶活力单位（U）,设3个平行,求平均值。已知420nm处ABTS摩尔消光系数ε₄₂₀=36 000L/(mol·cm)（Kalyani et al. 2008;司静等 2011a）。

1.7 还原糖含量测定

采用DNS法测定还原糖含量（秦俊哲和帅斌 2009）。

1.7.1 DNS试剂配制：称取3.15g DNS溶于500.0mL去离子水中,搅拌5s,水浴至45℃。加入100.0mL 0.2g/mL氢氧化钠溶液,期间不断搅拌,直至溶液清澈透明。再逐步添加91.0g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠,45℃水浴加热,补加300.0mL去离子水,期间不断搅拌,直至加入的物质完全溶解,冷却至室温后用去离子水定容至1.0L,室温下避光保存7d后备用。

1.7.2 标准曲线制作：准确配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/mL葡萄糖标准液。分别量取上述葡萄糖标准液0.5mL于8支20mL具塞刻度试管中,加入1.5mL DNS试剂,摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用去离子水定容至20.0mL,充分混匀。在540nm处测定吸光值,以反应体系中葡萄糖标准品的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标做标准曲线,计算回归方程为：y=0.057 6x-0.013 6,相关系数R²=0.997 1。

1.7.3 样品还原糖含量测定：取0.5mL离心后的上清液,加入1.5mL DNS试剂,摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用去离子水定容至20.0mL,按制作标准曲线的方法进行样品还原糖含量的测定。以去离子水替代上清液同体积的反应混合液为对照,还原糖含量以培养液中葡萄糖当量计。

1.8 多酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法测定多酚含量（张梅梅等 2011）。

1.8.1 标准曲线制作：准确配制0.08g/L没食子酸标准液。分别量取上述没食子酸标准液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mL,加入0.30mL 1.0mol/L Folin-Ciocalteu显色剂,混匀后避光放置8min,再加入0.60mL 10% Na₂CO₃溶液,混匀后室温下避光反应30min,用去离子水定容至5.0mL,混匀后于750nm处测定吸光值。以反应体系中没食子酸标准品的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标做标准曲线,计算回归方程为：y=0.235 0x-0.183 0,相关系数R²=0.996 8。

1.8.2 样品多酚含量测定：取5.0mL离心后的上清液,加入等体积的乙酸乙酯,重复萃取3次后,萃取液合并浓缩定容至5.0mL,按制作标准曲线的方法进行样品多酚含量的测定。以去离子水替代上清液同体积的反应混合液为对照,多酚含量以培养液中没食子酸当量计。

1.9 丙二醛含量测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：测定样品中MDA的含量,通常利用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）在酸性条件下加热与样品中的MDA发生显色反应,生成红棕色产物三甲双酮（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮）,三甲双酮的最大吸收峰在532nm。具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.10 总抗氧化能力测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：机体中有许多抗氧化物质,能使Fe³⁺还原成Fe²⁺,后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物,通过比色可测出其抗氧化能力的高低。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。定义在37℃下1.0mL样品1min内使反应体系的吸光值每增加0.01所需的样品量为1个T-AOC单位（U）。

1.11 超氧化物歧化酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子,后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,加入显色剂后显紫红色,在550nm处有最大吸收峰。当样品中含SOD时,则会以超氧阴离子为底物进行氧化,使形成的亚硝酸盐减少,得到的吸光值低于对照管的吸光值,以此可测定样品中SOD的活性。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。定义1.0mL样品中使超氧阴离子的抑制率达50%时所需的样品量为 1个SOD活力单位（U）。

1.12 过氧化氢酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：CAT分解H₂O₂的反应可通过加入钼酸铵（ammonium molybdate）而迅速终止,剩余的H₂O₂与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物,在405nm处测定其变化量,可计算出CAT的活力。具体步骤按试剂盒说明书进行。定义1.0mL样品1s内分解1μmol H₂O₂所需的样品量为1个CAT活力单位（U）。

1.13 过氧化氢水平测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：H₂O₂可以与钼酸铵作用生成一种络合物,在405nm处测定其生成量,即可计算出样品中H₂O₂的水平。具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.14 抗坏血酸含量测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：抗坏血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase,AAO）催化AA氧化生成二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid,DHA）,通过测定AA的氧化速率,即可计算出样品中AA的含量。具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.15 抑制羟自由基能力测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。原理：Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应,H₂O₂的量与Fenton反应产生的羟自由基量成正比,当给予电子受体后,用griess试剂显色,形成红色物质,其呈色与羟自由基的多少成正比关系。具体步骤按试剂盒说明书进行。定义1.0mL样品在37℃下1min内催化氧化1mmol/L H₂O₂所需的样品量为1个RAHFR单位（U）。

1.16 DPPH自由基清除能力测定

采用Brand-Williams et al.（1995）的方法测定DPPH自由基清除能力。

准确称取20.0mg DPPH,用无水乙醇溶解并定容至250mL容量瓶中,得到2.0×10^-4mol/L DPPH溶液。取2.0mL上清液及2.0mL 2.0×10^-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞试管中,充分摇匀,避光反应30min后在517nm处测定其吸光值A_i,同时测定2.0mL 2.0×10^-4mol/L DPPH溶液与2.0mL无水乙醇混合液的吸光值A_j。设3个平行,求平均值。根据下列公式计算样品对DPPH自由基的清除率：清除率=(1-A_i/A_j)×100,其中,A_i为添加样品后DPPH溶液的吸光值;A_j为未添加样品时DPPH溶液的吸光值。

1.17 统计分析

所得结果以平均值和标准差表示。利用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）、t-检验和LSD检验。**P<0.05和*P<0.01分别表示差异显著和差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌丝体生物量

为了解东方栓孔菌在液体培养过程中的生长状况,连续16d测定了其菌丝体生物量的变化（图1）。结果表明,液体培养基Ⅰ和Ⅱ中的菌丝体生物量均随着培养时间的增加而增长,且变化趋势基本一致,符合微生物接种后生长变化的规律,即菌体依次经过接种后的适应期、快速生长期、平缓期和衰退期。接种第6天时,菌丝体干重分别达到0.66g（液体培养基Ⅰ）和0.69g（液体培养基Ⅱ）,超过第14天时测得最大生物量[1.11g（液体培养基Ⅰ）和1.22g（液体培养基Ⅱ）]的一半,说明在这段时间内菌丝生长特别旺盛;接种8d后,菌丝生长基本停滞,或有下降趋势;14d时达到最大值,之后迅速下降,这可能是由于菌丝体的长时间培养而开始出现自溶现象所致;到第16天时生物量仅剩余0.43g（液体培养基Ⅰ）和0.68g（液体培养基Ⅱ）。对比之下,东方栓孔菌在两种液体培养基中各阶段的菌丝体生物量差异较小,说明该菌株对于缺营养条件也有较好的适应能力。

图1 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中菌丝体生物量的变化

Fig. 1 The variations of mycelial biomass of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.2 漆酶活性

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,属于多铜氧化酶家族,在木质素代谢过程中起重要作用（Rivera-Hoyos et al. 2013）。东方栓孔菌在液体培养过程中的漆酶活性变化见图2,前2d内东方栓孔菌分泌的漆酶活性较低,短暂的滞后期可能是由于菌株需要一定的时间来启动自身的抗氧化机制（D’Annibale et al. 2004）;第4天后开始迅速增加;于第8天在液体培养基Ⅰ中达到酶活最大值,为95.56U/L,而液体培养基Ⅱ中则为第10天（38.33U/L）;后期逐渐降低。对比之下,在液体培养基Ⅱ中的漆酶活性在整个培养过程中均较低,且出现峰值时间也晚,一方面原因在于液体培养基Ⅱ中匮乏的营养物质难以满足东方栓孔菌分泌大量漆酶的需求,另一方面原因可能是富含营养的复杂培养基更有利于诱导东方栓孔菌漆酶的分泌。

图2 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中漆酶活性的变化

Fig. 2 The variations of laccase activities of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.3 还原糖含量

东方栓孔菌在液体培养过程中的还原糖含量变化较大（图3）。与图1对比后发现,随着菌丝体生物量的增加,培养液中还原糖的含量迅速减少;且菌丝体生物量在培养第14天时处于最高峰值,还原糖含量也从最初的60.13mg/mL（液体培养基Ⅰ）和49.46mg/mL（液体培养基Ⅱ）降低至2.83mg/mL（液体培养基Ⅰ）和5.67mg/mL（液体培养基Ⅱ）。推测其原因在于培养液中的还原糖为东方栓孔菌菌丝体的生长提供了碳源,同时也为其合成所需的各种酶类提供了相应的能源,随着碳源的消耗,菌丝体生物量达到最大,这就使还原糖含量呈较低水平（李蕤等 2002）。此外,在4-8d之间,液体培养基Ⅰ中的还原糖含量急剧减少,第10天开始上升,随后再次降低至最低值并维持在该水平;而液体培养基Ⅱ中,还原糖含量则一直处于比较平缓的递减状态。这大概是由于在菌丝体生长的过程中,液体培养基Ⅰ中有其他营养物质转化为还原糖类,为菌丝体生长提供了速效碳源;而液体培养基Ⅱ中没有其他营养物质,因此还原糖含量一直处于降低趋势。

图3 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中还原糖含量的变化

Fig. 3 The variations of reducing sugar contents of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.4 多酚含量

多酚广泛分布于植物和真菌的次级代谢产物中,是一类由一个或多个芳香环与一个或多个羟基基团结合而成的天然化合物（Bravo 1998）。较多研究发现,多酚具有抗氧化、抗衰老、抑肿瘤、抑菌、免疫调节、降血脂血压和降胆固醇等多种功效（Balasundram et al. 2006）。本研究对东方栓孔菌液体培养过程中的多酚含量进行了测定（图4）。培养初期多酚含量很低,推测其原因在于菌丝体经过初步适应后开始生长,次生代谢产物（包括多酚类物质）的积累较菌丝体的生长延迟一段时间。随着培养时间的延长,多酚含量逐渐增加,在第8天时多酚含量达到最大值,分别为1.56mg/mL（液体培养基Ⅰ）和1.30mg/mL（液体培养基Ⅱ）;到第16天又急剧下降至0.85mg/mL（液体培养基Ⅰ）和0.83mg/mL（液体培养基Ⅱ）,这可能是总体环境中可供利用的营养贫乏、菌丝生长衰退、环境的变化等原因使其含量不断降低。总体而言,液体培养基Ⅰ中的多酚含量均高于液体培养基Ⅱ,说明丰富的营养物质能够刺激东方栓孔菌分泌次级代谢产物多酚的能力,并促进机体及时启动自身的抗氧化系统以抵御氧化胁迫,从而使其免于受到氧化损伤（Shao et al. 2015;Ahmad et al. 2016）。此外,对比后发现,东方栓孔菌在液体培养过程中的多酚含量与漆酶活性的变化规律基本一致,体现了二者作为机体内具抗氧化作用物质的协同关系。

图4 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中多酚含量的变化

Fig. 4 The variations of polyphenol contents of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.5 丙二醛含量

东方栓孔菌在液体培养过程中MDA含量的测定见图5。MDA是细胞膜脂质过氧化水平的标志,其含量能够直接反映出细胞的受损伤程度（Georgiou 1997;Ruktanonchai et al. 2009）,通常脂质过氧化水平的升高会导致菌株的生长及代谢状况发生改变（Zheng et al. 2010）。液体培养基Ⅰ和Ⅱ中的MDA含量随培养时间变化的趋势是完全一致的,且液体培养基Ⅰ的MDA含量明显高于液体培养基Ⅱ（图5）。在2-8d内,MDA含量处于上升阶段;于第8天达到最大值,分别为9.22nmol/L（液体培养基Ⅰ）和2.55nmol/L（液体培养基Ⅱ）;此后一直下降,在培养第16天时降低至1.25nmol/L（液体培养基Ⅰ）和0.52nmol/L（液体培养基Ⅱ）。同时,MDA含量与漆酶活性的变化趋于一致,说明产漆酶能力和氧化胁迫之间存在着一定的相关性,这可能是由于受损的真菌细胞引起了内部变化,激发了自身的抗氧化能力,进而启动自身的抗氧化机制以抵抗外来的氧化损害,这其中就包括对漆酶的分泌（Georgiou 1997）。

图5 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中丙二醛含量的变化

Fig. 5 The variations of malonaldehyde contents of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.6 总抗氧化能力

机体防御自由基氧化损伤的体系主要是通过与自由基发生反应,生成性质稳定且对机体无害的其他化合物而实现对自由基的清除作用。但其中的某一种抗氧化物质不足以防御较严重的氧化胁迫,只有通过体内各种成分的共同作用或通过激活整个防御系统才能使机体免于受到外界的氧化损伤（Limón-Pacheco & Gonsebatt 2009）。因此,T-AOC是评价抗氧化剂能力的综合性指标,它可以反映出机体酶系统和非酶系统的抗氧化活性,在总体上反映机体防御体系抗氧化能力的强弱（王晓宇等 2012）。即T-AOC是所有抗氧化性能的总和,可反映出机体总的防御能力的功能状态（Fraga et al. 2014）。图6显示了东方栓孔菌在液体培养过程中T-AOC的变化。可以看出,菌株培养的16d内,T-AOC均呈先上升后下降最后逐渐平稳的趋势。2-4d内,T-AOC迅速上升,分别由4.69U/mL（液体培养基Ⅰ）和3.25U/mL（液体培养基Ⅱ）增加至7.73U/mL（液体培养基Ⅰ）和5.96U/mL（液体培养基Ⅱ）;随后急剧下降,到第6天时T-AOC分别为4.23U/mL（液体培养基Ⅰ）和2.47U/mL（液体培养基Ⅱ）。从第6天开始,液体培养基Ⅰ中的T-AOC有较小程度的上升,并在第10天又出现一个小的峰值（4.93U/mL）,而液体培养基Ⅱ中的T-AOC则持续下降;最终两种培养基中的T-AOC都维持在14d时的最低值（2.18U/mL和1.56U/mL）且不再变化。

图6 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中总抗氧化能力的变化

Fig. 6 The variations of total antioxidant capacities of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.7 超氧化物歧化酶活性

SOD是一种结构中含铜、锌、铁和锰的金属酶,其主要功能是催化超氧阴离子发生歧化反应生成H₂O₂和分子氧,从而清除机体内积累的自由基,维持基本的代谢平衡,在抗氧化、抗衰老、抑肿瘤、治疗心血管疾病、抗炎、保健品加工等方面具有极为广泛的应用价值（Johnson & Giulivi 2005;Bafana et al. 2011）。本研究对东方栓孔菌在液体培养过程中的SOD活性进行了测定。结果显示,初始第2天时,液体培养基Ⅱ中的SOD活性处于最低值,为0.86U/mL,随后迅速上升,4d后持续上升但速度减缓,第16天达到最大值,为1.20U/mL;而在液体培养基Ⅰ中,SOD活性发生了一定程度的波动,分别于第4天和第16天出现了峰值,为1.12U/mL和1.17U/mL,第8天时的SOD活性最低,为0.91U/mL（图7）。这说明于液体培养基Ⅱ中培养的东方栓孔菌可以更好地清除机体内的自由基,维持代谢平衡,其原因可能是简单培养基缺乏足够营养物质的恶劣条件能够激发菌株产生更多的次级代谢产物,以更好地保护机体免受氧化损伤。

图7 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中超氧化物歧化酶活性的变化

Fig. 7 The variations of superoxide dismutase activities of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.8 过氧化氢酶活性

CAT是一种广泛存在于生物组织过氧化物体中的氧化还原酶,能够分解细胞内产生的或者由胞外进入胞内的H₂O₂,避免H₂O₂生成羟自由基（Djordjevic et al. 2010;Goetz et al. 2011;Huang et al. 2011）。东方栓孔菌液体培养过程中CAT活性的变化见图8,可以看到,液体培养基Ⅰ中CAT的活性前4d保持在最低值4.58U/mL左右,4-6d急剧上升,6d时达到峰值,为32.82U/mL,6-8d内波动较小,随后迅速下降至11.44U/mL,10d后趋于平缓;而在液体培养基Ⅱ中,CAT活性随着培养时间的增加变化不大,呈缓慢下降趋势,第10天有微小的起伏,可能是由于H₂O₂在此处的水平较高所致。对比图2后发现,东方栓孔菌在液体培养过程中的漆酶活性与CAT活性存在一定的相关性,二者同时达到最大值,推测原因可能在于漆酶与CAT同为抗氧化机制所需的酶,机体可通过其共同作用清除体内大量的H₂O₂和羟自由基。

图8 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中过氧化氢酶活性的变化

Fig. 8 The variations of catalase activities of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.9 过氧化氢水平

H₂O₂是由机体中的线粒体进行氧化呼吸链产能时生成的副产物,由于其性质不稳定,极易攻击细胞和体液中的生物大分子如DNA、脂类和蛋白质等。正常情况下,H₂O₂会被机体内的抗氧化系统所清除,而一旦体内产生和消除H₂O₂的平衡被打破,生物大分子被损害,就会引起机体发生病变（崔剑等 2000）。因此,本研究测定了东方栓孔菌在液体培养过程中H₂O₂水平的变化。菌株培养16d内,液体培养基Ⅱ中H₂O₂的水平全都低于液体培养基Ⅰ（图9）,说明液体培养基Ⅱ的无营养条件更有利于H₂O₂的清除,避免细胞损伤。对比图8后发现,CAT活性与H₂O₂水平呈负相关,这进一步显示了CAT分解H₂O₂的功能。

图9 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中过氧化氢水平的变化

Fig. 9 The variations of hydrogen peroxide levels of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.10 抗坏血酸含量

AA,又称维生素C,普遍存在于生物体中,是辅酶、自由基清除剂、电子供体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。AA的主要功能是抵抗机体氧化和降低过氧化水平（Branco et al. 2004）,其氧化还原状态反映了细胞内外环境的氧化还原状况,当遭遇逆境胁迫时,AA含量、相关代谢物和酶类均会发生相应的变化（马玉华等2008）。作为一种自由基清除剂,AA不仅能与超氧阴离子、羟自由基和H₂O₂作用形成AA自由基,保护机体免受内源性超氧阴离子的危害;而且,还可以在一些过渡金属离子的辅助下通过Fenton反应生成羟自由基,进而降低脂质过氧化水平（Georgiou & Petropoulou 2001;Xiao et al. 2011）。因而,AA是抗氧化系统的重要组成部分。东方栓孔菌在液体培养过程中AA含量的变化见图10,可以看到,液体培养基Ⅰ和Ⅱ中的AA含量变化趋势完全一致。前2-8d内基本保持不变,8-10d迅速升高,在第10天达到最大值,分别为3.17μmol/mL（液体培养基Ⅰ）和3.00μmol/mL（液体培养基Ⅱ）,10-12d迅速下降后基本无变化。对比之下还发现,东方栓孔菌液体培养过程中的AA含量与漆酶活性的变化基本同步。

图10 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中抗坏血酸含量的变化

Fig. 10 The variations of ascorbic acid contents of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.11 抑制羟自由基能力

羟自由基是机体产生的一种极具反应性的自由基,具有高度损伤性,其损伤能力几乎在每一个活细胞内都能被检测到。因此,清除羟自由基对于保护机体十分重要（Hochstein & Atallah 1988）。对东方栓孔菌液体培养过程中RAHFR的测定结果见图11,总体而言,液体培养基Ⅰ中的RAHFR较液体培养基Ⅱ波动更大。前2-4d内,两种培养基中的RAHFR均迅速增加;液体培养基Ⅰ中的RAHFR于第4天达到最大值,为92.92U/mL,随后开始降低,在14-16d内有所升高;而液体培养基Ⅱ中的RAHFR则于第6天缓慢增至最大值92.97U/mL,之后基本无变化。显然,液体培养基Ⅱ中的RAHFR在整个培养过程中都处于优势,对比之下,其变化趋势与SOD一致,说明在液体培养基Ⅱ中的东方栓孔菌能够更好地清除机体内的羟自由基,这可能是由于缺营养条件能够激发菌株分泌部分次级代谢产物或启动抗氧化机制,以保护机体免受氧化损伤。此外,RAHFR的提升又导致参与漆酶合成的羟自由基减少,进而表现出与漆酶活性呈负相关。

图11 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中抑制羟自由基能力的变化

Fig. 11 The variations of restraining abilities to hydroxyl free radicals of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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2.12 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种稳定的具有单电子的顺磁化合物,由于其结构简单,反应容易控制,在自由基清除剂作用下能接受电子或氢原子而形成稳定的化合物,使反应液变色,可用分光光度计进行快速分析,因此,目前已被广泛应用于植物和真菌提取物或者单一化合物的抗氧化特性评价中（Bondet et al. 1997;熊双丽等 2012;López-Alarcón & Denicola 2013）。东方栓孔菌在液体培养过程中对DPPH自由基的清除率见图12。在液体培养基Ⅰ中,东方栓孔菌在前6d内对DPPH自由基的清除率不断增加,第6天清除效果最强,达到48.57%;随后逐渐下降,10d后基本保持在10%左右。相对而言,液体培养基Ⅱ的东方栓孔菌对DPPH自由基的清除能力在前4d维持在65%-70%的高水平,之后急剧减小,在10-12d内开始回升,第16天又降至10%。说明东方栓孔菌对DPPH自由基具有较强的清除能力,且易受到来自不同培养基营养物质的影响。而液体培养基Ⅱ更有利于东方栓孔菌清除DPPH自由基,其原因大概是恶劣的营养环境对菌株抗氧化能力有一定的促进作用。对比图6后发现,东方栓孔菌对DPPH自由基的清除能力与T-AOC在整个培养过程中的变化趋势基本相同,判断二者具有相关性。推测是由于T-AOC的增长能够刺激超氧阴离子、羟自由基和H₂O₂水平的迅速上升,从而使得菌株对DPPH自由基的清除能力增强;但随着培养时间的增加、营养物质和生存条件的限制,微生物细胞逐渐衰亡,漆酶等次级代谢产物分泌量减少,致使T-AOC和DPPH自由基清除率明显降低。

图12 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中DPPH自由基清除能力的变化

Fig. 12 The variations of DPPH radicals scavenging abilities of white rot fungus Trametes orientalis during liquid cultivation.

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3 讨论

活细胞在必需的新陈代谢过程中会产生自由基。自由基是机体氧化过程中产生的副产物,主要包括超氧阴离子、羟自由基及H₂O₂等,大量研究表明,这些自由基涉及到许多体内调控系统,在正常情况下其产生与消除处于平衡状态,然而一旦这种平衡被打破,过多的自由基生成便会氧化细胞脂膜、蛋白质、DNA和酶等,进而对细胞造成致命性的损伤（徐靖 2013;Pisoschi & Pop 2015）。显然,机体会通过与自由基发生反应,生成性质稳定且对机体无害的其他化合物而实现对自由基的清除作用,或通过一些抗氧化物质以及体内各种成分的共同作用来激活整个防御系统使机体免于受到氧化损伤。其中,较为重要的就是酶类等次级代谢产物的抗氧化作用（Shon et al. 2003）。因此,本研究测定了东方栓孔菌在两种液体培养基条件下产漆酶过程中相关生理学指标的变化,以探讨真菌漆酶合成、菌株生长和抗氧化能力的相互关系,从而为进一步提高东方栓孔菌的产漆酶能力、缩短培养周期提供理论指导。

在液体培养过程中,东方栓孔菌对营养的利用以及生物量与漆酶活性变化有较大的相关性。本试验结果表明,东方栓孔菌在两种液体培养基中各阶段的菌丝体生物量差异较小,说明东方栓孔菌对于缺营养条件有较好的适应能力,富含营养的复杂培养基没有突显出优势。而整个过程中还原糖含量变化较大,并且,菌丝体生物量与培养液中还原糖的含量呈负相关,推测其原因在于培养液中的还原糖为东方栓孔菌菌丝体的生长提供了碳源,同时也为其合成所需的各种酶类提供了相应的能源,随着碳源的消耗,菌丝体生物量达到最大,这就使还原糖含量呈较低水平。

此外,东方栓孔菌在液体培养基Ⅱ中的漆酶活性在整个培养过程中均较低,且出现峰值时间也晚,一方面原因在于匮乏的营养物质不能满足漆酶分泌的需求,另一方面可能是由于复杂的培养基能更好地诱导东方栓孔菌分泌漆酶;然而其多酚含量、MDA含量、CAT活性、AA含量与漆酶活性的变化规律基本一致,说明产漆酶能力和氧化胁迫之间存在着一定的相关性,更加体现了其作为机体内具抗氧化作用物质的协同关系,这可能是由于受损的真菌细胞引起了内部变化,激发了自身的抗氧化能力,进而启动自身的抗氧化机制以抵抗外来的氧化损害,这其中就包括对漆酶、多酚、CAT、AA等的分泌。

研究结果还显示,菌株培养16d内,液体培养基Ⅱ中H₂O₂的水平均低于液体培养基Ⅰ,且RAHFR在整个培养过程中都处于优势,对比之下,其变化趋势与SOD一致,说明液体培养基Ⅱ的无营养条件可以更好地清除机体内的自由基,维持代谢平衡,其原因是简单培养基缺乏足够营养物质的恶劣条件能够诱导菌株产生更多的次级代谢产物,以更好地保护机体免受氧化损伤。此外,RAHFR的提升又导致参与漆酶合成的羟自由基减少,进而表现出与漆酶活性呈负相关。DPPH自由基清除能力测定结果表明,东方栓孔菌对DPPH自由基具有较强的清除能力,易受到来自不同培养基营养物质的影响,且其与T-AOC在整个培养过程中的变化趋势基本相同,判断二者具有相关性。

总之,白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中分泌漆酶活性的大小与菌株生长状况、抗氧化能力密切相关,且缺乏营养条件的简单培养基能够促进该菌提高分泌部分次级代谢产物的能力,而复杂培养基则能够更好地诱导东方栓孔菌分泌漆酶。

参考文献

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脚注

The authors have declared that no competing interests exist.

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国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS 24）

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摘要
Abstract
关键词
Key words
引用本文
1 材料与方法
1.1 供试菌株和试剂
1.2 培养基
1.3 活化及培养
1.4 种子发酵
1.5 样品制备
1.6 漆酶活性测定
1.7 还原糖含量测定
1.8 多酚含量测定
1.9 丙二醛含量测定
1.10 总抗氧化能力测定
1.11 超氧化物歧化酶活性测定
1.12 过氧化氢酶活性测定
1.13 过氧化氢水平测定
1.14 抗坏血酸含量测定
1.15 抑制羟自由基能力测定
1.16 DPPH自由基清除能力测定
1.17 统计分析
2 结果与分析
2.1 菌丝体生物量
图1 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中菌丝体生物量的变化
2.2 漆酶活性
图2 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中漆酶活性的变化
2.3 还原糖含量
图3 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中还原糖含量的变化
2.4 多酚含量
图4 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中多酚含量的变化
2.5 丙二醛含量
图5 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中丙二醛含量的变化
2.6 总抗氧化能力
图6 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中总抗氧化能力的变化
2.7 超氧化物歧化酶活性
图7 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中超氧化物歧化酶活性的变化
2.8 过氧化氢酶活性
图8 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中过氧化氢酶活性的变化
2.9 过氧化氢水平
图9 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中过氧化氢水平的变化
2.10 抗坏血酸含量
图10 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中抗坏血酸含量的变化
2.11 抑制羟自由基能力
图11 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中抑制羟自由基能力的变化
2.12 DPPH自由基清除能力
图12 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中DPPH自由基清除能力的变化
3 讨论
参考文献
脚注
基金

收稿日期	接受日期	出版日期
2014-02-25	2014-04-29	2015-05-15
发布日期
2015-05-15

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关键词

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引用本文

1 材料与方法

1.1 供试菌株和试剂

1.2 培养基

1.3 活化及培养

1.4 种子发酵

1.5 样品制备

1.6 漆酶活性测定

1.7 还原糖含量测定

1.8 多酚含量测定

1.9 丙二醛含量测定

1.10 总抗氧化能力测定

1.11 超氧化物歧化酶活性测定

1.12 过氧化氢酶活性测定

1.13 过氧化氢水平测定

1.14 抗坏血酸含量测定

1.15 抑制羟自由基能力测定

1.16 DPPH自由基清除能力测定

1.17 统计分析

2 结果与分析

2.1 菌丝体生物量

图1 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中菌丝体生物量的变化

2.2 漆酶活性

图2 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中漆酶活性的变化

2.3 还原糖含量

图3 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中还原糖含量的变化

2.4 多酚含量

图4 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中多酚含量的变化

2.5 丙二醛含量

图5 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中丙二醛含量的变化

2.6 总抗氧化能力

图6 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中总抗氧化能力的变化

2.7 超氧化物歧化酶活性

图7 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中超氧化物歧化酶活性的变化

2.8 过氧化氢酶活性

图8 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中过氧化氢酶活性的变化

2.9 过氧化氢水平

图9 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中过氧化氢水平的变化

2.10 抗坏血酸含量

图10 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中抗坏血酸含量的变化

2.11 抑制羟自由基能力

图11 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中抑制羟自由基能力的变化

2.12 DPPH自由基清除能力

图12 白腐真菌东方栓孔菌在液体培养过程中DPPH自由基清除能力的变化

3 讨论

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参考文献

脚注

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