朱红栓菌提取物抗氧化、抗肿瘤活性评价及相关化学成分分析

国利超; 吕建华; 姚澜; 姚清国; 张金秀; 王立安

doi:10.13346/j.mycosystema.180020

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菌物学报 ›› 2018, Vol. 37 ›› Issue (6) : 772-781. DOI: 10.13346/j.mycosystema.180020 CSTR: 32115.14.j.mycosystema.180020

朱红栓菌提取物抗氧化、抗肿瘤活性评价及相关化学成分分析

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Antioxidant and anti-tumor activities and main chemical constituent analysis of Trametes cinnabarina fruiting body extract

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摘要

采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇浸提朱红栓菌 Trametes cinnabarina 子实体干粉,得到不同极性提取物;采用清除DPPH 自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基能力,测定提取物的体外抗氧化活性;MTT法检测提取物对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用。结果表明,朱红栓菌石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物均具有一定的抗氧化、抗肿瘤活性;各提取物在浓度为4-5mg/mL时,对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力大小依次为乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>石油醚提取物;乙酸乙酯提取物对3种自由基的最高清除率分别为60.23%、74.49%、63.84%。各提取物对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖抑制作用大小依次为乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>石油醚提取物;乙酸乙酯提取物的抑制率最高达55.93%。采用硅胶和凝胶等柱色谱方法结合核磁、波谱和质谱等技术对乙酸乙酯提取物的化学组分进行分析,共分离纯化出11种化合物,分别鉴定为：麦角甾醇（1）,邻苯二甲酸二丁酯（2）,对羟基苯甲酸甲酯（3）,麦角甾-7,22,二烯-3-酮（4）,1-[(12E,16E)-12,16-二十碳二烯酰基]-2-[(E,E)-7,11-十八碳二烯酰基]-3-硬脂酰基甘油（5）,cinnabarin（6）,过氧麦角甾醇（7）,尿嘧啶（8）,甘露醇（9）,腺嘌呤核苷（10）,豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇（11）。除化合物6外均为首次从朱红栓菌子实体中分离得到。研究结果为开发利用朱红栓菌子实体提供了科学依据。

Abstract

Different polarity extract was prepared from Trametes cinnabarina fruiting body powder by petroleum ether, ethyl acetate and ethanol. The antioxidant activities of three kinds of the extract were evaluated by scavenging free radical ability of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl radical and superoxide anion radical. The results indicated that the extract possessed antioxidant activity in vitro. In terms of antioxidant activity, the ethyl acetate extract is the best among the three kinds of extract. The highest scavenging rate of DPPH radical, hydroxyl radical and superoxide anion radical was 60.23%, 74.49% and 63.84%, respectively. The anti-tumor activities of different extract were evaluated by MTT method via measuring inhibition rate of cell proliferation of HepG2 cell lines. The results showed that all kinds of extract displayed anti-tumor activities in vitro. The anti-tumor activity of ethyl acetate extract is the best, compared with ethanol extract and petroleum ether extract. The highest inhibition rate of the ethyl acetate extract to HepG2 cells was 55.93%. The chemical constituents of the ethyl acetate extract were isolated and purified using silica gel column chromatography. NMR and MS spectral analysis were used to identify the structure of obtained compounds. Eleven kinds of compounds were finally isolated and identified as follows: ergosterol (1), phthalic acid dibutyl ester (2), methyl 4-hydroxybenzoate (3), ergosta-7,22-dien-3-one (4), 1-[(12E,16E)-12,16-eicosadienoyl]-2-[(E,E)-7,11-octadecadienoyl]-3-stearoylglycerol (5), cinnabarin (6), ergosterol peroxide (7), uracil (8), mannitol (9), adenosine (10) and (22E, 24S)-24-methyl-5α-choleata-7, 22-diene-3β, 5, 6β-triol (11). All compounds except for cinnabarin were isolated from the fruiting body of T. cinnabarina for the first time. The results provide scientific basis for development and utilization of fruiting body of T. cinnabarina.

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国利超, 吕建华, 姚澜, 姚清国, 张金秀, 王立安. 朱红栓菌提取物抗氧化、抗肿瘤活性评价及相关化学成分分析[J]. 菌物学报, 2018, 37(6): 772-781 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.180020

GUO Li-Chao, LÜ Jian-Hua, YAO Lan, YAO Qing-Guo, ZHANG Jin-Xiu, WANG Li-An. Antioxidant and anti-tumor activities and main chemical constituent analysis of Trametes cinnabarina fruiting body extract[J]. Mycosystema, 2018, 37(6): 772-781 https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.180020

自20世纪40年代从丝状真菌Penicillium chrysogenum发现青霉素（penicillin）以来,从真菌中寻找抗菌、抗氧化、抗肿瘤等先导化合物引起国内外学者高度重视。20世纪80年代,瑞士Sandoz公司从一种虫草Cordyceps subsessilis中发现了选择性的免疫抑制剂环孢菌素（cyclosporine）,这种药物现在被广泛用于人体器官移植后的抗排斥作用（Borel & Kis 1991）。德国学者从高等真菌嗜球果伞Strobilurus tenacellus 中发现了具有杀霉菌活性的先导化合物strobilurin,依此为母体,开发的Kresoxim-methyl、Amistar等新型杀菌剂全世界每年的销售额已达到5亿多美元（Clough 1993）。后来,在真菌中发现的其他一系列非常有用的化合物或重要先导化合物,如FK-506、rapamycin、acarbose、mevinolin等,使菌物学家、天然产物化学家对真菌的多样性和创造性赞叹不已（刘吉开 2007）。

木栓质多孔菌中研究较多的为灵芝,其含有的萜类物质灵芝酸具多种生物活性。其次为桦褐孔菌Inonotus obliquus,从中分离鉴定出多种新型抗氧化酚类物质（Lee et al. 2006;Ham et al. 2008）。

朱红栓菌Trametes cinnabarina具有多种药用价值,对小白鼠肉瘤180的抑制率高达90%,对子宫颈癌也有一定的抑制作用（陈士瑜 1997;黄年来 1998）。此外,朱红栓菌能转化罂粟碱类成分蒂巴因碱（theoine）,获得新型止痛药（刘亮镜等 2009）。郭夏立（2013）釆用大孔树脂静态吸附和动态洗脱相结合的方法分离提取了朱红栓菌发酵液中的色素。朱峰等（2014）研究发现,朱红栓菌甲醇粗提物对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌和金黄葡萄球菌具一定抗菌活性,并从粗提物中分离获得两个吩噁嗪酮类生物碱,通过波谱分析分别鉴定为朱红菌素（1）和朱红栓菌素（2）。吕建华等（2017）对朱红栓菌菌丝体乙酸乙酯提取物进行了分离纯化,得到了11种化合物。但对于朱红栓菌子实体主要化学成分的研究国内外均鲜有报道。本文对人工栽培获得的朱红栓菌子实体不同极性提取物进行了体外抗氧化和抗肿瘤活性评价,并对活性较好的乙酸乙酯提取物的化学组分进行了纯化分析,以期为开发利用朱红栓菌子实体提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 子实体及细胞株：朱红栓菌Trametes cinnabarina菌株保存于河北师范大学真菌实验室。子实体由本实验室采用袋装木屑栽培方法得到。人肝癌细胞株HepG2细胞引自中国人民解放军白求恩国际和平医院肝病中心。

1.1.2 试剂：石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、无水甲醇、氯仿、丙酮均为国产分析纯,氘代试剂为进口色谱纯,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH（Sigma）,DMEM高糖培养液（Gibco）,胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）,四氮唑蓝（MTT）、邻苯三酚、抗坏血酸（Vc）、三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 仪器：旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;循环水多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂）;核磁共振仪ZMD（德国BRUKER光谱仪器公司）;电子天平（上海精密科学仪器有限公司）;移液枪（德国Eppendorf）;酶标仪（美国Thermo）;真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;二氧化碳细胞培养箱（Heal Force）。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备：400g朱红栓菌子实体干粉,用4L石油醚浸提3次,每次12h,抽滤后合并滤液,于旋转蒸发器40℃减压浓缩,得石油醚提取物16.12g;残渣烘干后再用4L乙酸乙酯浸提3次,每次12h,抽滤后合并滤液,40℃减压浓缩得乙酸乙酯提取物12.17g;烘干残渣最后用95%乙醇4L浸提3次,每次12h,合并滤液于45℃减压浓缩,得乙醇提取物23.45g。

1.2.2 提取物体外抗氧化活性评价：提取物对DPPH自由基清除能力的测定：参考Bondet et al.（1997）的方法,稍作改动。首先将3种提取物样品用甲醇分别配制成不同浓度的溶液,DPPH用无水乙醇配制成0.2mmol/L溶液,于4℃避光保存。取100μL不同浓度的样品溶液,加入100μL的DPPH溶液,充分混匀,避光反应30min,测定517nm处的吸光值,记为A_i;同样操作,测定100μL样品溶液和100μL无水乙醇溶液于517nm处的吸光值,记为A_j;同样操作,测定100μL甲醇和100μL DPPH溶液于517nm处的吸光值,记为A₀。以Vc作为阳性对照,每组设置3个平行实验,按下述公式计算DPPH自由基清除活性：

DPPH自由基清除率(%)=[A₀-(A_i-A_j)]/A₀×100

提取物对羟自由基清除能力的测定：参照Govindan et al.（2016）的方法,稍作改动。将3种提取物样品用95%乙醇分别配制成不同浓度的溶液。取100μL硫酸亚铁溶液（1.5mmol/L）、70μL过氧化氢溶液（6mmol/L）、30μL水杨酸钠溶液（20mmol/L）及100μL不同浓度的样品溶液混匀,反应体系在37℃下孵育1h,测定510nm处的吸光值,记为A_i;同样操作,以超纯水代替水杨酸钠溶液,测定510nm处的吸光值,记为A_j;同样操作,以95%乙醇代替样品溶液,测定510nm处的吸光值,记为A₀。以Vc作为阳性对照,每组设置3个平行实验,按下述公式计算羟自由基清除活性：

羟自由基清除率(%)=[A₀-(A_i-A_j)]/A₀×100

提取物对超氧阴离子自由基清除能力的测定：参照文献Najafabad & Jamei（2014）的方法,稍作改动。将3种提取物样品用95%乙醇分别配制成不同浓度的溶液。取100μL不同浓度的样品溶液和100μL Tris-HCl缓冲液（50mmol/L,pH 8.2）混合,25℃水浴加热20min,然后加入25℃水浴预热的7μL邻苯三酚溶液（30mmol/L）,迅速混匀,于25℃水浴中反应6min,加7μL HCl（10mol/L）以终止反应,测定325nm处的吸光值,记为A_i;同样操作,以0.1mol/L HCl代替邻苯三酚溶液,测定325nm处的吸光值,记为A_j;同样操作,以95%乙醇代替样品溶液,测定325nm处的吸光值,记为A₀。以Vc作为阳性对照,每组设置3个平行实验,按下述公式计算超氧阴离子自由基清除活性：

超氧阴离子自由基清除率(%)=[A₀-(A_i-A_j)]/A₀×100

1.2.3 提取物体外抗肿瘤活性测定：参照Ferrari et al.（1990）的方法,稍作改动,采用MTT法。取对数生长期的HepG2肝癌细胞,调细胞浓度至1×10⁵个/mL后,吸取100μL接种于96孔板中,在二氧化碳培养箱中培养24h,培养条件为37℃、5% CO₂。提取物分别用少量DMSO溶解,用无血清的RPMI1640培养基稀释至终浓度为50、100、200、400、800μg/mL。向培养细胞中加入100μL各浓度提取物,对照组和空白组加等量的无血清培养基。每处理均设6个复孔。培养48h后,离心去上清,每孔加100μL 1mg/mL的MTT溶液,继续培养4h后,离心去上清,每孔加入二甲基亚砜150μL,振荡10min,于酶标仪检测570nm处吸光度A。根据下列公式计算各处理的细胞增殖抑制率：

细胞增殖抑制率(%)=(1-\(\frac{A_{实验组}}{A_{对照组}}\))×100

1.2.4 乙酸乙酯提取物的分离纯化及单一组分结构测定：对朱红栓菌乙酸乙酯提取物进行分离纯化,用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,最后用甲醇冲洗,收集石油醚-乙酸乙酯（10:1）洗脱液,采用硅胶柱和Sephadex LH-20柱层析,得到化合物3（17mg）、化合物4（11mg）、化合物5（8mg）;收集石油醚-乙酸乙酯（5:1）洗脱液,采用硅胶柱和Sephadex LH-20柱层析,进一步分离纯化获得化合物1（15mg）和化合物2（9mg）;收集石油醚-乙酸乙酯（1:1）洗脱液,采用硅胶柱柱层析,进一步分离纯化获得化合物6（32mg）、化合物7（6mg）、化合物11（8mg）;收集纯甲醇洗脱液,减压浓缩后进行反复硅胶柱层析得到化合物8（13mg）、化合物9（25mg）、化合物10（8mg）。采用核磁共振波谱和质谱确定单一组分结构。

2 结果与分析

2.1 提取物体外抗氧化活性

2.1.1 各提取物对DPPH自由基的清除作用：朱红栓菌乙醇、乙酸乙酯和石油醚提取物均表现一定的清除DPPH自由基的能力,且随着处理浓度的增加,清除率逐渐增高,表现出明显的量效关系。其中,朱红栓菌乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力最强,在浓度为5mg/mL时清除率达到60.23%,其次为乙醇提取物和石油醚提取物（图1）。

2.1.2 各提取物对羟自由基的清除作用：朱红栓菌乙醇、乙酸乙酯和石油醚提取物均具有一定的清除羟自由基的能力。随着处理浓度的增加,各提取物清除率呈现先增高后降低的趋势。在处理浓度为4mg/mL时,朱红栓菌乙酸乙酯提取物清除率最高,达到74.49%,其次为乙醇提取物和石油醚提取物（图2）。

图1 朱红栓菌子实体各提取物对DPPH自由基清除活性

Fig. 1 The scavenging capacities of three kinds of extract from fruiting body of Trametes cinnabarina for DPPH free radical.

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图2 朱红栓菌子实体各提取物对羟自由基清除活性

Fig. 2 The scavenging capacities of three kinds of extract from fruiting body of Trametes cinnabarina for hydroxyl free radical.

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2.1.3 各提取物对超氧阴离子自由基的清除作用：朱红栓菌各提取物均具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力,且随着处理浓度的增加,清除率逐渐增高,表现出明显的量效关系。其中,朱红栓菌乙酸乙酯提取物在处理浓度为5mg/mL时清除率达到最高值63.84%,其次为乙醇提取物和石油醚提取物（图3）。

图3 朱红栓菌子实体各提取物对超氧阴离子自由基的清除活性

Fig. 3 The scavenging capacities of three kinds of extract from fruiting body of Trametes cinnabarina for superoxide anion radical.

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综上所述,朱红栓菌子实体各提取物对3种自由基均表现一定的清除能力,即体外抗氧化活性,且在浓度为4-5mg/L时,对3种自由基清除能力大小依次为乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>石油醚提取物。乙酸乙酯提取物对3种自由基的最高清除率分别为60.23%、74.49%、63.84%。

2.2 提取物体外抗肿瘤活性

朱红栓菌各提取物对HepG2细胞的增殖均具有一定的抑制能力,表明其具有一定的体外抗肿瘤活性。随着处理浓度的增加,抑制率呈现微弱增高的趋势。在相同处理浓度条件下,对HepG2细胞的增殖抑制作用大小依次为乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>石油醚提取物。乙酸乙酯提取物在浓度为800μg/mL时,抑制率最大为55.93%（图4）。

图4 朱红栓菌子实体各提取物对HepG2肝癌细胞增殖的抑制率

Fig. 4 The inhibition rate of three kinds of extract from fruiting body of Trametes cinnabarina to HepG2 cell proliferation.

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2.3 朱红栓菌乙酸乙酯提取物的化学组分分析

共从乙酸乙酯提取物中分离纯化出11种化合物（图5）,其中,除化合物6外,均为首次从朱红栓菌子实体中分离得到。具体结构、波谱数据和名称如下。

化合物1：无色结晶（三氯甲烷）。FAB-MS m/z 396 [M]⁺。¹H-NMR (CDCl₃, 500MHz) δ:3.62 (1H, m, H-3), 5.37 (1H, br s, H-6), 5.55 (1H, d, J=3.2Hz, H-7), 0.62 (3H, s, H-18), 0.93 (3H, s, H-19), 1.03 (3H, d, J= 6.6Hz, H-21), 5.16 (1H, dd, J=15.2, 7.8Hz, H-22), 5.22 (1H, dd, J=15.2, 7.2Hz, H-23), 0.83 (3H, d, J=7.1Hz, H-26), 0.82 (3H, d, J=7.2Hz, H-27), 0.91 (3H, J=6.8Hz, H-28). ¹³C-NMR (CDCl₃, 125MHz) δ:39.2 (C-1), 32.1 (C-2), 70.5 (C-3), 40.9 (C-4), 139.9 (C-5), 119.7 (C-6), 116.4 (C-7), 141.4 (C-8), 46.4 (C-9), 37.1 (C-10), 21.2 (C-11), 38.5 (C-12), 42.9 (C-13), 54.7 (C-14), 23.1 (C-15), 28.4 (C-16), 55.9 (C-17), 12.2 (C-18), 16.4 (C-19), 40.6 (C-20), 21.2 (C-21), 132.1 (C-22), 135.7 (C-23), 42.9 (C-24), 33.2 (C-25), 19.8 (C-26), 20.1 (C-27), 17.7 (C-28)。以上波谱数据与文献报道基本一致（吕子明等 2008）,故鉴定化合物1为麦角甾醇。

化合物2：黄色油状（三氯甲烷）。EI-MS m/z: 279[M+H]⁺。¹H-NMR (Methanol-d4, 500MHz) δ:7.72 (2H, dd, J=5.7, 3.3Hz, H-2, 5), 7.61 (2H, dd, J=5.7, 3.3Hz, H-3, 4), 4.29 (4H, t, J=6.6Hz, H-1′, 1′′), 1.72 (4H, m, H-2′, 2′′), 1.46 (4H, m, H-3′, 3′′), 0.97 (6H, m, H-4′, 4′′).¹³C-NMR (Methanol-d₆, 125MHz) δ:169.3 (C-7, 7′), 133.7 (C-1, 6), 132.3 ( C-3, 4), 129.9 (C-2, 5), 66.7 (C-1′, 1′′), 31.7 (C-2′, 2′′), 20.3 (C-3′, 3′′), 14.0 (C-4′, 4′′)。以上波谱数据与文献报道基本一致（严振等 2010）,故鉴定化合物2为邻苯二甲酸二丁酯。

图5 从朱红栓菌子实体中分离纯化出11种化合物的结构

Fig. 5 Structure of obtained compounds from fruiting body of Trametes cinnabarina.

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化合物3：无色针晶（三氯甲烷）。¹H-NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.95 (2H, dd, J=8.5, 2.4Hz,H-2 and H-6), 6.92 (2H, dd, J=8.5, 2.4Hz, H-3 and H-5), 3.94 (3H, s, OCH₃). ¹³C-NMR (150MHz, CDCl3) δ: 165.9 (-COOCH₃), 162.0 (C-4), 131.3 (C-2, 6), 120.6 (C-1), 115.3 (C-3, 5), 51.6 (-OCH₃)。以上波谱数据与文献报道基本一致（赵丹丹等 2012）,故鉴定化合物3为对羟基苯甲酸甲酯。

化合物4：无色结晶（三氯甲烷）。EI-MS m/z (%): 396[M], [M]⁺(5), 381 (1), 353 (4), 298 (14), 274 (30), 69 (88), 246 (17), 229 (26), 215 (17)。¹H-NMR (600MHz, CDCl₃) δ_H: 0.55 (3H, s, H-18), 0.83 (3H, d, J= 6.4Hz, H-26), 0.81 (3H, d, J=6.6Hz, H-27), 0.92 (3H, d, J=6.9Hz, H-28), 1.04 (3H, s, H-19), 1.03 (3H, d, J=6.7Hz, H-21), 5.55 (1H, dd, J=15.4, 7.7Hz, H-22), 5.24 (1H, m, H-7), 5.32 (1H, dd, J=15.5, 7.2Hz, H-23); ¹³C-NMR (150MHz, CDCl₃) δ_C: 37.7 (t, C-4), 38.7 (t, C-2), 211.2 (s, C-3), 43.1 (t, C-4), 43.3 (d, C-5), 31.1 (t, C-6), 118.1 (d, C-7), 138.7 (s, C-8), 47.8 (d, C-9), 35.2 (s, C-10), 22.7 (t, C-11), 38.7 (t, C-12), 44.6 (s, C-13), 56.5 (d, C-14), 23.2 (t, C-15), 28.6 (t, C-16), 56.9 (d, C-17), 13.3 (q, C-18), 12.7 (q, C-19), 41.5 (d, C-20), 22.3 (q, C-21), 136.5 (d, C-22), 132.6 (d, C-23), 43.5 (d, C-24), 32.1 (d, C-25), 20.2 (q, C-26), 19.6 (q, C-27), 18.7 (q, C-28)。以上波谱数据与文献报道基本一致（Rösecke & König 2000）,故鉴定化合物4为麦角甾-7,22-二烯-3-酮。

化合物5：无色油状物（三氯甲烷）：EI-MS m/z: 910.1[M]⁺。¹H-NMR (400MHz, CDCl₃) δ_H: 5.35 (8H, m, 4×CH=CH), 5.29 (1H, m, H-2), 4.35 (2H, dd, J= 4.3, 11.9Hz, H-1), 4.13 (2H, dd, J=4.3, 11.9Hz, H-3), 2.78 (2H, t, J=5.9Hz, C=C-CH₂-C=C), 2.31 (6H, m, 3×α-CH), 2.05 (12H, m, 6×C=C-CH₂), 1.61 (6H, brs, 3×β-CH₂), 1.26 (58H, m, 29×-CH₂), 0.89 (9H, m, 3X-CH₃); ¹³C-NMR (150MHz, CDCl₃) δ_C:173.2, 173.1, 172.7, 130.1, 130.1, 130.0, 129.9, 129.9, 128.1, 128.0, 127.9, 68.9(C-1, 3), 62.1(C-2), 34.1, 34.0, 34.0, 31.9, 31.9, 31.5, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.5, 29.4, 29.3, 29.3, 29.3, 29.2, 29.2, 29.1, 29.1, 29.0, 27.2, 27.2, 27.2, 25.6, 24.9, 24.8, 22.7, 22.6, 14.1, 14.0。以上波谱数据与文献报道基本一致（Dixson et al. 2011）,故鉴定化合物5为1-[(12E, 16E)-12, 16-二十碳二烯酰基]-2-[(E, E)-7, 11-十八碳二烯酰基]-3-硬脂酰基甘油。

化合物6：红色粉末（石油醚-乙酸乙酯）。¹H-NMR (DMSO-d6, 500MHz) δ:15.3 (1H, s, -COOH), 9.59 (1H, br s, 2-NHa), 8.74 (1H, br s, 2-NHb), 7.54 (1H, m, H-7), 7.52 (1H, m, H-8), 7.47 (1H, d, J=7.6Hz, H-6), 6.62 (1H, s, H-4), 5.51 (1H, t, J=5.1Hz, 12-OH), 4.88 (2H, d, J=5.1Hz, H-12). ¹³C-NMR (DMSO-d6, 125MHz) δ:177.9 (C-3), 169.1 (C-11), 152.2 (C-2), 151.1 (C-10a), 146.2 (C-4a), 142.1 (C-5a), 138.1 (C-9), 130.0 (C-7), 127.0 (C-9a), 123.8 (C-8), 114.8 (C-6), 105.1 (C-4), 92.4 (C-1), 58.9 (C-12)。以上波谱数据与文献报道基本一致（Dias & Urban 2009）,故鉴定化合物6为cinnabarin。

化合物7：无色针晶（三氯甲烷）。EI-MS m/z: 428[M]⁺。¹H-NMR (600MHz, CDCl₃) δ_H: 6.48 (1H, d, 8.5), 6.22 (1H, d, 8.5, H-6), 5.21 (1H, dd, 7.6, 7.5, H-7), 5.14 (2H, m, H-22, 23), 3.93 (1H, m, H-3), 2.06-1.48 (2H, m), 1.23 (3H, s), 0.96 (3H, d, 6.6), 0.89 (3H, d, 6.8), 0.85 (3H, s), 0.81 (3H, d, 3.6), 0.77 (3H, d, 3.4); ¹³C-NMR (150MHz, CDCl₃) δ_C: 34.2 (t, C-1), 30.4 (t, C-2), 66.3 (d, C-3), 37.1 (t, C-4), 82.0 (s, C-5), 135.3 (d, C-6), 130.7 (d, C-7), 79.5 (s, C-8), 51.3 (d, C-9), 37.2 (s, C-10), 23.5 (t, C-11), 39.2 (t, C-12), 44.4 (s, C-13), 51.4 (d, C-14), 20.4 (t, C-15), 28.4 (t, C-16), 56.4 (d, C-17), 12.8 (q, C-18), 18.1 (q, C-19), 39.6 (d, C-20), 20.8 (q, C-21), 135.1 (d, C-22), 132.3 (d, C-23), 42.7 (d, C-24), 33.0 (q, C-25), 19.0 (d, C-26), 19.5 (q, C-27), 17.5 (q, C-28)。以上波谱数据与文献报道基本一致（Ma et al. 1994）,故鉴定化合物7为过氧麦角甾醇。

化合物8：白色粉末（甲醇）。EI - MS m/z:112[M⁺, 100], 69[M⁺-NHCO], 42[69-HCN]。¹H-NMR (DMSO-d6, 500MHz) δ:10.98 (2H, br s, 1-NH, 3-NH), 7.39 (1H, d, J=7.6Hz, H-6), 5.44 (1H, d, J=7.6Hz, H-5)。¹³C-NMR (DMSO-d6, 125MHz) δ:164.3 (C-4), 151.5 (C-2), 142.2 (C-6), 100.2 (C-5)。以上波谱数据与文献报道基本一致（Miyaoka et al. 2000）,故鉴定化合物8为尿嘧啶。

化合物9：无色结晶（甲醇）。EI - MS m/z:182[M]⁺。¹H-NMR (DMSO-d6, 500MHz) δ: 4.41 (2H, d, J=5.4Hz, 2-OH, 5-OH), 4.33 (2H, t, J=5.5Hz, 1-OH, 6-OH), 4.14 (2H, d, J=7.1Hz, 3-OH, 4-OH), 3.35-3.62 (8H, H-1-6). ¹³C-NMR (DMSO-d6, 125MHz) δ:71.4 (C-3, C-4), 69.7 (C-2, C-5), 63.9 (C-1, C-6)。以上波谱数据与文献报道基本一致（蒋海强等 2008）,故鉴定化合物9为甘露醇。

化合物10：白色粉末（甲醇）。EI-MS m/z: 268[M+H]⁺。¹H-NMR (DMSO-d6, 500MHz) δ:8.36 (1H, s, H-2), 8.13 (1H, s, H-8), 7.36 (2H, s, -NH2), 5.21 (1H, d, J=4.6Hz, H-1), 4.61(1H, dd, J=11.3, 6.3Hz H-4), 4.15(1H, dd, J=7.6, 4.6Hz, H-2), 3.96 (1H, dd, J =6.3, 3.4Hz, H-3), 3.67 (1H, m, H-5^,a), 3.55 (1H, m, H-5^,b). ¹³C-NMR (DMSO-d6, 125MHz) δ:156.1 (C-6), 152.2 (C-2), 149.1 (C-4), 139.9 (C-8), 119.4(C-5), 87.9 (C-1), 85.9 (C-4), 73.5 (C-2), 70.5 (C-3), 61.7 (C-5)。以上波谱数据与文献报道基本一致（朱明洪等 2016）,故鉴定化合物10为腺嘌呤核苷。

化合物11：无色结晶（乙酸乙酯）：ESI - MS m/z:247[M+H]⁺, ¹H-NMR (DMSO-d₆, 600MHz), δ: 5.23 (1H, dd, J=10.0, 4.9Hz, 22-H), 5.20 (1H, dd, J=10.0, 5.5Hz, 23-H), 5.09 (1H, s, 7-H), 4.50 (1H, d, J=5.2Hz, 6-OH), 4.25 (1H, d, J=5.2Hz, 3-OH), 3.77 (1H, m, 3-H), 3.60 (1H, s, 5-OH), 3.37 (1H, brs, 6-H), 1.84-2.03 (6H, m, 2a, 9, 12, 20, 24-H), 1.80-1.84 (1H, m, 14-H), 1.59-1.66 (2H, m, 16-H), 1.26-1.51 (1H, m, 1, 2b, 4, 11, 15, 17, 25-H), 0.98 (3H, d, J=6.5Hz, 21-CH₃), 0.90 (3H, s, 19-CH₃), 0.88 (3H, d, J=7.2Hz, 27-CH₃), 0.80 (3H, d, J=6.0Hz, 28-CH₃), 0.79 (3H, d, J=5.6Hz, 26-CH₃), 0.55 (3H, s, 18-CH₃);¹³C-NMR (DMSO-d₆, 125MHz) δ:139.8 (C-8), 135.4 (C-22), 119.5 (C-7), 131.5 (C-23), 72.3 (C-6), 74.5 (C-5), 66.0 (C-3), 55.4 (C-17), 43.1 (C-13), 54.2 (C-14), 42.3 (C-9), 40.2 (C-2), 42.1 (C-24), 40.1 (C-20), 39.0 (C-12), 36.7 (C-10), 31.2 (C-4), 32.5 (C-11, 25), 27.7 (C-16), 22.6 (C-15), 21.0 (C-21), 21.4 (C-1), 19.5 (C-27), 19.8 (C-26), 12.1 (C-18), 17.7 (C-19), 17.3 (C-18)。以上波谱数据与文献报道基本一致（祁翠翠等 2013）,故鉴定化合物11为豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇。

3 讨论

本研究首次证实人工栽培获得的朱红栓菌子实体乙酸乙酯提取物表现出较好的体外抗氧化、抗肿瘤活性,并首次从乙酸乙酯提取物中分离纯化出10种组分（cinnabarin除外）,为进一步开发利用人工栽培获得的朱红栓菌子实体提供了科学依据。

从获得化合物结构、性质看,获得的单体化合物还不能与提取物表现出的抗氧化、抗肿瘤活性形成明显的对应关系,可能的主要原因是采用的分离纯化技术只能获取子实体含量较大的组分,含量较少、活性较高的组分不易获得纯品,正在通过提高分离纯化技术解决此问题。但分离物质中,据文献报道,有些与抗氧化、抗肿瘤有关。如,麦角甾醇是食药用真菌中含有的一种重要的抗肿瘤因子,Kobori et al.（2007）研究表明,麦角甾醇和过氧麦角甾醇能够抑制RAW264.7细胞中LPS诱导的炎症反应,同时还对直肠癌细胞HT29的生长有抑制作用。宋明杰等（2015）研究了椭圆嗜蓝孢孔菌中四种甾类化合物的抗肿瘤活性,结果表明,麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物、麦角甾‐7,22‐二烯‐3β‐醇‐棕榈酸酯和麦角甾‐4,6,8(14),22(23)‐四烯‐3‐酮在体内和体外均具有一定的抗肿瘤活性。本研究共从乙酸乙酯提取物分离纯化出4种甾类物质,麦角甾醇,含量为0.0038%,过氧麦角甾醇,含量为0.0015%,麦角甾-7,22,二烯-3-酮,含量为0.0028%,豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇,含量为0.0020%,提取物表现良好的抑制HepG2肝癌细胞增殖的活性可能与这些甾类物质有关。

Yilmaz et al.（2007）研究表明,甘露醇可以显著降低颅脑损伤小鼠脑组织中丙二醛、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平。说明甘露醇能够促进过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的利用从而发挥其抗氧化的作用,从而减少丙二醛的生成来降低细胞的损伤。本研究分离纯化获得甘露醇,含量为0.0013%,可以推断,朱红栓菌乙酸乙酯提取物所表现的良好的体外抗氧化活性可能与甘露醇等多元醇类化合物有关。

此外,本研究还从朱红栓菌子实体中分离纯化出尿嘧啶（含量0.0013%）、腺嘌呤核苷（含量0.0013%）两个含氮杂环类化合物。腺嘌呤核苷是一种能够引起许多生理反应的信号分子,腺苷类似物及其共轭化合物被认为是潜在的治疗药物。许多腺苷受体抑制剂被认为是治疗炎症、2型糖尿病以及心律不齐的潜在药物（Samsel & Dzierzbicka 2011）。在小鼠热痛觉的炎症模型中,直接和间接作用的腺苷类药物,可通过激活脊髓腺苷A1受体来产生镇痛作用（Poon & Sawynok 1998）。Sheng et al.（2014）研究表明,尿嘧啶作为UDP-葡萄糖的前体,可以作为产生普鲁兰多糖的一种催化剂,普鲁兰是一种无毒性、低粘性和高可塑性的胞外多糖,被广泛用于食品和制药领域。

本研究分离获得的cinnabarin（含量0.0080%）与朱峰等（2014）所报道的cinnabarin结构相同。朱峰等（2014）、Smânia et al.（1998）均报道cinnabarin具有一定的抗菌能力,尤其对食物中产生的蜡状芽孢杆菌和明串珠菌有较强的抗菌能力。

本研究分离获得的邻苯二甲酸二丁酯（含量0.0023%）、对羟基苯甲酸甲酯（含量0.0043%）、1-[(12E, 16E)-12, 16-二十碳二烯酰基]-2-[(E, E)-7, 11-十八碳二烯酰基]-3-硬脂酰基甘油（含量0.0020%）等脂肪酸类化合物的生物活性有待进一步研究。

参考文献

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脚注

The authors have declared that no competing interests exist.

基金

河北省科技计划重点项目（16237301D）

河北省现代农业产业技术体系创新团队项目（HBCT2013060201）

河北师范大学科技类技术创新基金（L2017K03）

2017年河北师范大学研究生创新资助项目（CXZZSS2017059）

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收稿日期	接受日期	出版日期
2018-01-30	2018-04-03	2018-06-20
发布日期
2018-06-20

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