作为真核生物的一个重要类群,真菌在海洋生态系统的物质循环过程中发挥关键作用。研究海洋环境中真菌多样性、生物地理分布模式及其影响因素,对于更好地认识微生物如何响应人类活动影响与全球气候变化具有重要意义。随着研究手段的发展,特别是高通量测序技术的广泛应用,近些年海洋真菌分子生态学研究取得了一些重要成果。同时,也存在一些问题与不足。随着我国科学研究向深远海发展战略的实施,我国学者近些年也开始涉足深远海真菌多样性研究,取得了不错的成绩。为系统了解海洋真菌分子多样性、群落组成以及时空分布模式的研究现状,作者针对该领域的研究概况作一综述。同时,提出目前存在的问题与未来研究展望。
为明确四川省草莓灰葡萄孢Botrytis cinerea群体遗传结构及其多样性水平,采用ISSR分子标记技术对分离自四川省10个县（市）的195株灰葡萄孢菌进行了遗传多态性分析。结果表明,四川省灰葡萄孢菌多态性丰富,6条ISSR引物共产生了63个多态性位点,应用Popgene32软件计算四川省不同主产区域（除德阳广汉种群外）种群的Nei’s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）均达到了H>0.2、I>0.3的水平,表明四川省的灰葡萄孢菌具有丰富的遗传多样性;灰葡萄孢菌群体的遗传多样性（Ht）均值为0.2976,种群内遗传多样性（Hs=0.2458）远远高于种群间（Dst=0.0518）的遗传多样性;遗传分化系数（Gst）均值0.1742,基因流（Nm）均值2.3696,说明该地区灰葡萄孢菌种群间遗传分化不明显,群体内基因交流频繁。通过UPGMA法和Omishare Tools热图软件均可将10个采集点分为3个类群,来自绵阳江油的菌株单独构成一个类群,来自成都崇州和德阳广汉的菌株构成一个类群,其余的菌株构成另外一个类群;利用Structure 2.3软件对195份灰葡萄孢菌进行群体结构分析,可将134份菌株划分成21个群,另外61个菌株被列为混合群体。
致病疫霉Phytophthora infestans为马铃薯晚疫病的重要病原菌。通过从昆明市寻甸县采集110P和H-6两株致病疫霉,明确其染色体倍性、交配型、线粒体单倍型、毒性和甲霜灵敏感性,经对峙培养,利用改良的卵孢子萌发方法获得有性生殖F1代群体POP1（60株）,并对POP1进行表型和基因型测定。结果表明：冷冻处理24h为最佳条件,卵孢子萌发率达5.09%±0.15%;POP1的交配型、毒性和甲霜灵敏感性均发生了分离,其中交配型分离比为A1:A2:A1A2:自育型（SF）=16:5:17:22,毒性分离比为抗性（R）:敏感性（S）=11:49,甲霜灵敏感性分离比为抗性（R）:敏感性（S）=2:58;3个表型的分离均偏离孟德尔单基因显性遗传特点。基于8对SSR多态性引物对POP1基因型分析表明,遗传相似系数为0.98时,可将所有菌株分为14个基因型;遗传相似系数为0.95时,可将POP1分为6个分支,其中优势群体为S1,占分离群体的61.67%。关联分析进一步表明,8对SSR所代表的基因型和几个重要表型有显著相关性（R2=0.6667）。本研究建立了高效的致病疫霉卵孢子萌发体系,解析了有性生殖后代群体遗传结构特点,为深入探索致病疫霉的变异规律及病害流行趋势提供了理论基础。
为了解不同产地米槁Cinnamomum migao根际土壤真菌多样性及其差异,探讨米槁活性成分、土壤理化因子与其土壤真菌群落的联系。本文采用高通量测序技术对云南、贵州及广西的9个产点米槁根际土壤真菌群落组成和结构进行分析,测定不同产地米槁的主要活性成分及土壤理化因子,同时对米槁活性成分及其与土壤理化因子和根际土壤真菌种群多样性进行相关性分析。结果表明,米槁根际土壤真菌物种可归入8门、30纲、89目、200科、440属,优势类群为一未能分类的属,相对丰度为18.76%,其次为被孢霉属Mortierella（16.37%）等;不同产地米槁根际土壤真菌群落组成存在差异,最高多样性指数出现在贵州罗甸,随后依次为贵州望谟、广西乐业、广西天峨、贵州册亨、贵州荔波、云南富宁、云南那坡、贵州贞丰;总体而言,广西乐业、贵州望谟和广西天峨3地米槁果实样本活性成分1,8-桉叶素（1,8-cineole）、香桧烯（sabinene）、柠檬烯（limonene）和α-松油醇（α-terpineo）的含量均高于其他样本;冗余分析（redundancy analysis,RDA）结果表明,部分真菌类群与米槁药用活性成分呈正相关。
为了解褐环乳牛肝菌Suillus luteus对樟子松Pinus sylvestris var. mongolica和油松Pinus tabulaeformis根际土壤真菌群落结构的影响,采用Illumina MiSeq高通量测序,对两种松树接种S. luteus与对照组的根际土壤真菌群落结构进行研究。结果显示,4个样品共获得原始序列347 681条,归为5个真菌门。综合各土壤样品真菌Alpha多样性指数及OTUs-Venn图,发现接种S. luteus后樟子松和油松根际土壤真菌相对丰度与对照存在一定差异。群落结构分析表明,接种S. luteus提高了樟子松和油松根际土壤担子菌和壶菌的相对丰度,抑制了子囊菌门真菌。优势属由原来的Geopora转变为Suillus。通过PCA分析与NMDS分析发现接种S. luteus后樟子松和油松根际土壤真菌群落差异性增加,且接种S. luteus后樟子松根际土壤真菌群落结构相似性显著高于油松根际土壤真菌群落结构相似性。接种S. luteus的樟子松和油松土壤真菌丰富度降低、多样性增加,接种S. luteus改变了樟子松和油松根际土壤真菌群落结构和优势真菌种群。试验结果为樟子松和油松促生真菌菌种筛选和育苗工作提供了依据。
真菌次级代谢产物是医药活性成分的重要来源之一。就真菌基因组编码的次级代谢基因簇数量而言,由于普遍存在的基因沉默现象,常规培养中能够分离鉴定的化合物种类一般很有限。广谱杀虫的罗伯茨绿僵菌在液体培养基中的主要代谢产物为非核糖体环肽类的破坏素,本研究在对破坏素合成缺失突变株ΔdtxS1进行液体培养时获得了新的产物峰,对其中一个产物峰进行分离、纯化及结构鉴定,确定该化合物为螺环类的pseurotin A。结合在烟曲霉菌中解析的pseurotin A合成途径,推测获得了罗伯茨绿僵菌中的潜在合成基因簇,并推测了pseurotin A在绿僵菌中的合成途径。本研究首次在绿僵菌中鉴定获得pseurotin A,并揭示了在真菌中通过对主要次级代谢产物缺失的方法可以鉴定获得新型的化合物。
尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（FOC）是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）FoSlt2信号通路在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育、细胞壁完整性和致病性方面发挥着重要作用。为了揭示FoSlt2信号通路的致病机理和寻找农药靶标,本研究利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和FoSlt2敲除突变体菌株的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 164个,其中上调表达基因有1 184个,下调表达基因有980个。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,差异表达基因主要参与在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学通路中。KEGG 功能富集分析结果表明,差异基因主要参与戊糖和葡糖醛酸盐转换、氨基糖和核苷酸糖、氨基葡聚糖降解、磷酸肌醇和碳类物质代谢通路,说明这些通路与尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育和致病性相关。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型致病机制的阐明奠定了理论基础。
对采自海南省白沙县鹦哥岭阔叶树腐木上的标本,根据形态学特征和多基因分析,鉴定为脆木耳Auricularia fibrillifera,经分离纯化获得纯菌株作为实验材料,为了充分利用和开发木耳属资源,首次对该种的生物学特性和驯化栽培进行了研究。研究不同碳源、氮源、无机盐和生长因子在固体培养条件下对脆木耳菌丝生长的影响,对以上4个因素进行单因素试验,从中选出3个最优的水平进行正交试验。结果表明：脆木耳菌丝最适生长温度为33℃,最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为牛肉粉,最佳无机盐添加量为1.5% PO43--1% Mg2+,最佳生长因子为玉米汁。驯化栽培过程中,栽培配方为：木屑78%,麸皮20%,石膏粉1%,石灰粉1%,发菌温度为22℃可使脆木耳菌丝在40d左右满袋,且生长旺盛,可培育出子实体。
毛榆孔菌Elmerina hispida在生长过程中分泌出一种很重要的酶——纤维素酶,纤维素酶在工业废水处理、有机颜料脱色等方面具有重要的利用价值。为充分开发利用毛榆孔菌这一野生资源,本研究采用十字画线法测定不同碳源、氮源、pH和温度对毛榆孔菌菌丝生长的影响,从4个单因素试验中选取3个最优水平进行正交试验。研究结果表明,毛榆孔菌菌丝的最适生长碳源是可溶性淀粉,最适生长氮源是酵母膏,最适温度是25℃,最适pH 7.0。驯化栽培的栽培基质为78%木屑,20%麦麸,1%石灰,1%石膏（质量比）,30d左右出现原基,40d以后原基分化,形成子实体。通过测定毛榆孔菌在栽培过程中4个不同时期的纤维素酶,发现酶活力最高可达805.63U/g。本试验成功对毛榆孔菌进行了人工驯化栽培,为该菌进一步的研究和开发提供参考。
为研究酸法脱酰胺修饰对刺芹侧耳蛋白质的功能特性和消化性的影响,本研究以刺芹侧耳粉为原料,通过碱提酸沉法提取刺芹侧耳蛋白质,并采用0.175mol/L盐酸、57.5℃改性,改性时间为121min 5s,制备出脱酰胺修饰蛋白质,探索脱酰胺改性对蛋白质的消化性及功能特性的影响。结果表明：脱酰胺修饰可提高刺芹侧耳蛋白质的溶解性、持油性、起泡性和乳化性,但对其持水性的改善作用不明显;同时脱酰胺修饰蛋白质表面疏水性和荧光强度增大,蛋白质巯基和二硫键含量变化不明显;体外消化率提高,消化产物的多肽含量降低,游离氨基酸含量增大。酸法脱酰胺修饰可在一定程度上有效改善蛋白质的功能特性和提高蛋白质的体外消化水平。
本实验对前期研究得到的具有高产红色素能力的产紫青霉突变菌株Penicillium purpurogenum Li-3-9的发酵条件进行优化的同时作出了对红色素的安全性评价。在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken试验设计优化了蔗糖浓度、酵母膏浓度和装液量对红色素色价的影响;并且研究了P. purpurogenum Li-3-9产生的红色素对斑马鱼胚胎的毒性效应。结果表明,最佳发酵条件为：蔗糖40g/L、酵母膏4g/L、装液量为45mL、接种量4%、培养温度32℃、初始pH值6.9、培养时间168h、摇床转速150r/min,红色素色价最高达到了11.4U/mL。通过计算斑马鱼胚胎致死率、心率、畸形率及孵化率可知,该色素无致死毒性,并且对斑马鱼胚胎发育具有一定的促进作用。
比较蝉虫草子实体、孢梗束、虫体以及蝉虫草发酵菌丝体的胞内多糖含量、单糖组成和分子量差异,结果表明,蝉虫草子实体与发酵菌丝中胞内多糖的含量和组成均存在差异。葡萄糖、半乳糖和甘露糖是蝉虫草发酵菌丝体和子实体粗多糖中主要的3种单糖,阿拉伯糖和木糖是子实体粗多糖中的特征性单糖,而果糖属于菌丝体的特征性单糖。子实体粗多糖中高分子量组分（>1×10 6Da）的相对含量明显高于菌丝体粗多糖。本研究对提升蝉虫草发酵多糖产品品质、促进蝉虫草开发应用具有参考价值。
利用索氏萃取技术,依次采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇等5种溶剂对蝉虫草纯粉进行分级萃取,运用傅里叶变换红外光谱分析法和气相色谱-质谱联用技术对5级萃取物进行分析鉴定。傅里叶变换红外光谱分析显示萃取物中含有与烯烃类、羧酸类、酯类、醇类和酮类等化合物相关的C-H、C=O、C-O和C=C等官能团。气相色谱-质谱联用技术共鉴定出有机小分子化合物34种,以酯类和脂肪酸类为主,多为碳链长度为15-20的长链脂肪酸及对应的酯,其中十八碳不饱和脂肪酸相对含量高达28.95%;分别存在于两种或以上萃取物中的有机化合物共有11种;仅存于石油醚萃取物中的化合物6种,乙酸乙酯萃取物中3种,丙酮萃取物中2种,无水乙醇萃取物中6种,甲醇萃取物中6种。在一定极性范围内,利用溶剂的极性梯度变化,可实现蝉虫草中活性物质的按极性梯度分离;采用分级萃取技术可有效分离蝉虫草中部分化学成分。鉴定结果充实了蝉虫草中化合物的种类资源,为蝉虫草中活性物质谱图库的完善、构效关系的建立及蝉虫草产品的利用开发提供支撑。
通过HPLC指纹图谱结合多元线性回归分析对不同产地灵芝子实体的功效性特征进行评价,为寻找灵芝中活性三萜提供理论依据。利用高效液相分析方法,结合样品对肿瘤细胞L1210的增殖抑制率,运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件和多元线性回归分析11批不同品种灵芝子实体中的三萜活性成分。样品与标准指纹图谱的相似度均在0.9以上,共标定了12个共有物质峰,其中与抗L1210肿瘤细胞活性关系密切的三萜物质有灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸K、灵芝酸A、灵芝酸F和灵芝醛A。
本文通过对佐剂性关节炎大鼠原发性和继发性足肿胀度的测量、全身关节炎指数评分、体重及体态变化、免疫脏器指数、炎性踝关节切片的形态以及血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、前列腺素E2、一氧化氮和一氧化氮合成酶等指标来考察蜜环菌Armillaria mellea的5个不同提取物对佐剂性关节炎大鼠的影响及作用机理。结果表明,蜜环菌甲醇提取物对原发性和继发性足肿胀有明显的抑制;甲醇组能明显抑制佐剂性关节炎大鼠脾脏和胸腺萎缩,并能抑制血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6和前列腺素E2的分泌,抑制大鼠踝关节炎细胞的形成。因此蜜环菌提取物中甲醇提取物对佐剂性关节炎大鼠治疗效果最显著。
为高效率发酵生产GA3,对藤仓赤霉菌发酵过程pH进行优化调控研究。采用5L全自动发酵罐,在pH 3.0-5.0条件下,对藤仓赤霉菌菌丝生长及GA3产量的影响进行了考察,实验数据表明：在pH 4.0条件下,菌比生长速率可获最大值,为0.395/h;而pH 3.0条件下,GA3比生成速率最大,达到4.43mg/(g?h)。基于不同pH条件下,对菌比生长速率、得率、GA3比生成速率的影响,提出GA3分批发酵过程中的pH调控策略,即：0-20h,pH自然;20-50h,pH 4.0;50-80h,pH 3.0-3.5;80h后控制pH为3.5-4.0。在此控制模式下,经过196h发酵GA3的终产量达到2 224mg/L,GA3产率44.5mg/g,GA3生产强度0.242mg/(L?h),分别比不控制pH条件下发酵的数值增长了7.75%、7.74%、8.04%,表明该pH控制策略能增进GA3发酵生产效率。
低温大曲是清香型白酒酿造的核心因素之一,为酿造过程提供了物系、酶系和菌系。酵母菌是白酒发酵过程中最重要的功能微生物类群,研究大曲中的酵母菌种类和含量具有重要意义,对大曲质量评价也具有重要参考价值。但用常规酵母菌分离技术和培养基从大曲中分离酵母菌时易受优势丝状真菌（霉菌）的干扰,霉菌常常很快长满培养皿,将酵母菌覆盖,难以对酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化。本研究根据酒醅发酵过程中随乙酸和乳酸含量的升高,霉菌含量急剧降低而酵母菌含量逐渐升高的现象,用常规培养基YPD为基础培养基,测试了添加不同量的乙酸、乳酸和丙酸（后者为常用食品防腐和防霉剂）,以及不同比例的乙酸乳酸组合物,对低温大曲中霉菌的抑制效果和对酵母菌生长的影响进行探究,发现在灭菌后的YPD中添加3.3mL/L乙酸、2.0mL/L丙酸或在乙酸乳酸1:3的情况下添加2.0mL/L乙酸,30℃培养3-5d之内可有效抑制低温大曲中的霉菌,实现对酵母菌的有效分离、计数和纯化培养,而单加乳酸对霉菌,特别是黄曲霉的抑制效果差。随后测试了以前我们从清香型白酒大曲和酒醅发酵过程中分离的13属18种酵母菌在这些培养基上的生长情况,发现这些酵母菌中的绝大多数,尤其是大曲和酒醅中的优势酵母菌种,均可以在这些加酸培养基上良好生长。综合考虑培养基的成本、配制的简便性及分离效果等因素,本研究推荐将灭菌后添加3.3mL/L乙酸的YPD固体培养基作为低温大曲酵母菌分离和定量计数的优化培养基。
