‘公农1号’苜蓿不同组织和涝害胁迫下内参基因的筛选评价

doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2026.04.002

草地学报 ›› 2026, Vol. 34 ›› Issue (4): 1146-1157.DOI: 10.11733/j.issn.1007-0435.2026.04.002

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‘公农1号’苜蓿不同组织和涝害胁迫下内参基因的筛选评价

徐艺^1,2, 王婷¹, 郭玉朋³, 苗兴芬², 郑霞^1,4, 石鹏君^1,4

1. 中国农业科学院麻类研究所, 湖南长沙 410221;
2. 黑龙江八一农垦大学农学院, 黑龙江大庆 163319;
3. 青海民族大学生态环境与资源学院, 青海西宁 810007;
4. 中国农业科学院国家南繁研究院, 海南三亚 572024

收稿日期:2025-04-15 修回日期:2025-06-13 发布日期:2026-04-15
通讯作者: 苗兴芬，E-mail：byndmxf@126.com；郑霞，E-mail：zhengxia@caas.cn
作者简介:徐艺（1996-），女，汉族，山东济宁人，硕士研究生，主要从事牧草种质资源创新与利用研究，E-mail：xuyi01010219@163.com；王婷（1998-），女，汉族，甘肃会宁人，硕士研究生，主要从事苜蓿逆境分子生物学研究，E-mail：82101235179@caas.cn；
基金资助:
湖南省自然科学基金-省市联合基金（2022JJ50021）；中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-IBFC）；三亚中国农业科学院国家南繁研究院“南繁专项”（YYLH2505）资助

Evaluation and Screening of Reference Genes in Alfalfa （Medicago sativa L. ‘Gongnong No.1’） Different Tissues under Waterlogging Stress

XU Yi^1,2, WANG Ting¹, GUO Yu-peng³, MIAO Xing-fen², ZHENG Xia^1,4, SHI Peng-jun^1,4

1. Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha, Hunan Province 410221, China;
2. College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang Province 163319, China;
3. The College of Ecological Environment and Resources, Qinghai Minzu University, Xining, Qinghai Province 810007, China;
4. National Nanfan Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Sanya, Hainan Province 572024, China

Received:2025-04-15 Revised:2025-06-13 Published:2026-04-15

摘要/Abstract

摘要： 紫花苜蓿（Medicago sativa L.）内参基因的稳定性和适用性因品种、生长发育及环境条件的不同差异较大。本研究以紫花苜蓿‘公农1号’为材料，使用qRT-PCR技术与geNorm，NormFinder，BestKeeper和RefFinder等软件，评估8个常见内参基因GAPDH，UBL-2a，Rer1，eEF-1α，ADF，UBC，TUB和Actin等不同时期的组织表达特异性以及涝害胁迫下的表达稳定性。结果表明，‘公农1号’幼苗期稳定的内参基因是Rer1，Actin，UBC，其中叶、茎和根中表达最稳定的内参基因分别是Actin，Rer1，GAPDH；成株期最稳定的内参基因是ADF，Actin，TUB，而成株期叶、茎、根和花中表达最稳定的分别是eEF-1α，Rer1，Actin和UBL-2a。涝害胁迫下，幼苗期叶片稳定性前三的内参基因为TUB，ADF和eEF-1α，根部为ADF，UBL-2a和Rer1；成株期叶中稳定性前三的内参基因为ADF，Actin和TUB，根部为UBL-2a，UBC和ADF。Rer1和UBL-2a的稳定性受发育时期和组织特异性影响较小，适合用作组织表达特异性研究的内参基因；ADF适合作为涝害胁迫研究的内参基因。

关键词: 紫花苜蓿, 内参基因, 非生物胁迫, 表达稳定性

Abstract: The stability and applicability of reference genes in alfalfa vary significantly depending on the cultivar， growth and development stages， and environmental conditions. In this study， alfalfa （Medicago sativa L.） cultivar ‘Gongnong No.1’ was used as material， and eight candidate reference genes， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH， ubiquitin protein ligase 2a UBL-2a， Retention in Endoplasmic Reticulum Rer1， eukaryotic elongation factor-1 alpha eEF-1α， actin-depolymerizing factor ADF， ubiquitin carrier protein UBC， tubulin beta-1 chain TUB， and Actin were selected to evaluate their expression stability of different tissues in seedling and adult plant， as well as under waterlogging stress. The analysis employed quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and four softwares， including geNorm， NormFinder， BestKeeper， and RefFinder. The results showed that， at the seedling stage， Rer1， Actin， and UBC were the most stable reference genes. At the tissue level， the most stable reference genes for leaves， stems， and roots were Actin， Rer1， and GAPDH， respectively. At the adult stage， ADF， Actin， and TUB exhibited the highest stability， while the most stable reference genes for leaves， stems， roots， and flowers were eEF-1α， Rer1， Actin， and UBL-2a， respectively. Under waterlogging stress， the three most stable reference genes in seedling leaves were TUB， ADF， and eEF-1α， whereas in seedling roots they were ADF， UBL-2a， and Rer1. In the adult stage， the most stable genes were ADF， Actin， and TUB in leaves， and UBL-2a， UBC， and ADF in roots. Overall， Rer1 and UBL-2a are recommended as reference genes for studies of tissue-specific expression， as their stability was less affected by developmental stage or tissue type. ADF and TUB are suitable reference genes for studies involving waterlogging stress.

Key words: Alfalfa, Reference genes, Abiotic stress, Expression stability

中图分类号:

S541

徐艺, 王婷, 郭玉朋, 苗兴芬, 郑霞, 石鹏君. ‘公农1号’苜蓿不同组织和涝害胁迫下内参基因的筛选评价[J]. 草地学报, 2026, 34(4): 1146-1157.

XU Yi, WANG Ting, GUO Yu-peng, MIAO Xing-fen, ZHENG Xia, SHI Peng-jun. Evaluation and Screening of Reference Genes in Alfalfa （Medicago sativa L. ‘Gongnong No.1’） Different Tissues under Waterlogging Stress[J]. Acta Agrestia Sinica, 2026, 34(4): 1146-1157.

参考文献

[1] WANG Y Z，RUAN Q，ZHU X L，et al. Identification of alfalfa SPL gene family and expression analysis under biotic and abiotic stresses[J]. Scientific Reports，2023，13：84
[2] LIU L，SI L，ZHANG L S，et al. Metabolomics and transcriptomics analysis revealed the response mechanism of alfalfa to combined cold and saline-alkali stress[J]. The Plant Journal，2024，119（4）：1900-1919
[3] LORENZO C D，GARCÍA-GAGLIARDI P，ANTONIETTI M S，et al. Improvement of alfalfa forage quality and management through the down-regulation of MsFTa₁[J]. Plant Biotechnology Journal，2020，18（4）：944-954
[4] CAO G，DONG H，CHE Z，et al. Effects of waterlogging stress on the yield and quality of alfalfa varieties[J]. Acta Agrestia Sinica，2017，25（1）：135-141 曹刚，董慧，车钊，等. 淹水胁迫对不同紫花苜蓿品种产量和品质的影响[J]. 草地学报，2017，25（1）：135-141
[5] ZENG N B，YANG Z J，ZHANG Z F，et al. Comparative transcriptome combined with proteome analyses revealed key factors involved in alfalfa （Medicago sativa） response to waterlogging stress[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（6）：1359
[6] TIRRY N，KOUCHOU A，OMARI B EL，et al. Improved chromium tolerance of Medicago sativa by plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR）[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology，2021，19（1）：149
[7] LI G，MA J W，YIN J L，et al. Identification of reference genes for reverse transcription-quantitative PCR analysis of ginger under abiotic stress and for postharvest biology studies[J]. Frontiers in Plant Science，2022，13：893495
[8] GACHON C，MINGAM A，CHARRIER B. Real-time PCR： what relevance to plant studies？[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55（402）：1445-1454
[9] CASTONGUAY Y，MICHAUD J，DUBÉ M P. Reference genes for RT-qPCR analysis of environmentally and developmentally regulated gene expression in alfalfa[J]. American Journal of Plant Sciences，2015，6（1）：132-143
[10] XIE C C，MA J，LI J，et al. Selection of quantitative real-time reverse transcription-PCR reference genes in lead-stressed bermudagrass roots treated with different concentrations of melatonin[J]. Pratacultural Science，2025，42（1）：119-128 谢程程，马均，李璟，等. 不同浓度褪黑素缓解狗牙根铅胁迫实时荧光定量PCR内参基因的筛选[J]. 草业科学，2025，42（1）：119-128
[11] DENG J S，FENG C，ZHANG L H，et al. Screening of eggplant qRT-PCR internal reference genes under different tissues and adversity stresses[J]. China Vegetables，2024（8）：37-46 邓嘉硕，冯程，张泷昊，等. 不同组织与逆境胁迫下茄子qRT-PCR内参基因筛选[J]. 中国蔬菜，2024（8）：37-46
[12] SHI K，DONG H B，DU H L，et al. The chromosome-level assembly of the wild diploid alfalfa genome provides insights into the full landscape of genomic variations between cultivated and wild alfalfa[J]. Plant Biotechnology Journal，2024，22（6）：1757-1772
[13] CHEN H T，ZENG Y，YANG Y Z，et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa[J]. Nature Communications，2020，11：2494
[14] FU Y Y，MU C S，GAO H W，et al. Cloning of 18S rRNA gene and stability evaluation of reference genes in Medicago sativa[J]. Plant Physiology Journal，2014，50（12）：1809-1815 付媛媛，穆春生，高洪文，等. 紫花苜蓿18S rRNA基因的克隆及内参基因表达稳定性评价[J]. 植物生理学报，2014，50（12）：1809-1815
[15] ZHANG W，CUI W T，DUAN X L，et al. Reference gene selection for qRT-PCR normalization in alfalfa under UV-B irradiation[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，2015，38（2）：248-254 张薇，崔为体，段星亮，等. UV-B胁迫下紫花苜蓿qRT-PCR内参基因的筛选[J]. 南京农业大学学报，2015，38（2）：248-254
[16] LIU Q N，WANG B J，XU W，et al. Genome-wide investigation of the PIF gene family in alfalfa （Medicago sativa L.） expression profiles during development and stress[J]. BMC Genomic Data，2024，25（1）：79
[17] CHEN X F，XU H L，WANG R X，et al. Effects of flooding stress on biological characteristics of different alfalfa varieties and evaluation of their waterlogging tolerance[J]. Grassland and Turf，2024，44（2）：155-163 陈小芳，徐化凌，王瑞香，等. 9个紫花苜蓿品种对淹水胁迫的响应及耐涝性评价[J]. 草原与草坪，2024，44（2）：155-163
[18] ZHANG Q，LIU X F，ZHANG Z F，et al. Melatonin improved waterlogging tolerance in alfalfa （Medicago sativa） by reprogramming polyamine and ethylene metabolism[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：44
[19] ZHAO H X，ZHAO S Y，CAO Y P，et al. Development of a single transcript CRISPR/Cas9 toolkit for efficient genome editing in autotetraploid alfalfa[J]. The Crop Journal，2024，12（3）：788-795
[20] ZHANG L S，SUN Y G，JI J Q，et al. Flavonol synthase gene MsFLS13 regulates saline-alkali stress tolerance in alfalfa[J]. The Crop Journal，2023，11（4）：1218-1229
[21] WANG Q，WU J Z，DI G L，et al. Identification of cold tolerance transcriptional regulatory genes in seedlings of Medicago sativa L. and Medicago falcata L[J]. International Journal of Molecular Sciences，2024，25（19）：10345
[22] PU J，LI M Y，MAO P，et al. Genome-wide identification of the Q-type C₂H₂ transcription factor family in alfalfa （Medicago sativa） and expression analysis under different abiotic stresses[J]. Genes，2021，12（12）：1906
[23] VANDESOMPELE J，DE PRETER K，PATTYN F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology，2002，3（7）：RESEARCH0034
[24] ANDERSEN C L，JENSEN J L，ØRNTOFT T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data： a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research，2004，64（15）：5245-5250
[25] PFAFFL M W，TICHOPAD A，PRGOMET C，et al. Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity： BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters，2004，26（6）：509-515
[26] PARK H J，SHABASHVILI D，NEKORCHUK M D，et al. Retention in endoplasmic reticulum 1 （RER1） modulates amyloid-β （Aβ） production by altering trafficking of γ-secretase and amyloid precursor protein （APP）[J]. The Journal of Biological Chemistry，2012，287（48）：40629-40640
[27] YUE W N，XU T Y，MIAO J M，et al. Screening of reference genes in different tissues and hormone treatments of alfalfa[J/OL].https：//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？filename=CYCP20240517001&dbname=CJFD&dbcode=CJFQ， 2024-05-22/2025-04-14 岳炜楠，胥通玉，苗佳敏，等. 紫花苜蓿不同组织及不同激素处理下内参基因的筛选[J/OL]. https：//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？filename=CYCP20240517001&dbname=CJFD&dbcode=CJFQ， 2024-05-22/2025-04-14
[28] LIU M X，FU Y，WANG Y，et al. Study on HPT gene expression regulation of Medicago sativa under cobalt stress[J]. Molecular Plant Breeding，2015，13（12）：2713-2720 刘绵学，伏毅，王艳，等. Co胁迫下紫花苜蓿HPT基因的表达调控研究[J]. 分子植物育种，2015，13（12）：2713-2720
[29] XIE F L，XIAO P，CHEN D L，et al. miRDeepFinder： a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs[J]. Plant Molecular Biology，2012，80（1）：75-84

‘公农1号’苜蓿不同组织和涝害胁迫下内参基因的筛选评价

Evaluation and Screening of Reference Genes in Alfalfa （Medicago sativa L. ‘Gongnong No.1’） Different Tissues under Waterlogging Stress

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[1]	陶雅, 孙启忠, 那亚, 李峰, 李文龙, 李晓燕, 乌英嘎. 明清苜蓿植物图考[J]. 草地学报, 2026, 34(2): 501-508.
[2]	郭美莹, 刘亚玲, 李晓霞, 刘希强, 赵彦. ‘中苜3号’紫花苜蓿对不同盐碱胁迫的生长和生理响应[J]. 草地学报, 2026, 34(2): 509-517.
[3]	李迪娜, 王凯, 陶佳丽, 许涛, 李青秀, 朱慧森, 岑慧芳. 偏关苜蓿MsMYB44基因的克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 草地学报, 2026, 34(1): 33-42.
[4]	陈崎, 张岩, 霍晓伟, 伊风艳, 石凤翎, 高翠萍, 栗振义, 张志强. 紫花苜蓿MsTIFY10a基因对植物抗寒性的影响[J]. 草地学报, 2025, 33(9): 2786-2795.
[5]	王雪丽, 王云玲, 齐开源, 严海军, 王显国, 孟根其格木, 周立业. 水分调控对不同品种紫花苜蓿生产性能及土壤酶的影响[J]. 草地学报, 2025, 33(9): 2808-2819.
[6]	刘茜, 陈薇薇, 高卉, 万伟帆, 赵坤, 胡海娜, 李海港. 紫花苜蓿幼苗氮磷养分吸收和根系特征对土壤磷和钼添加的响应[J]. 草地学报, 2025, 33(9): 2820-2831.
[7]	石菁, 刘晓静, 李佳奇, 韩颜隆, 汪雪, 王静. 15个紫花苜蓿品种在民勤地区的适应性研究[J]. 草地学报, 2025, 33(9): 2843-2853.
[8]	袁玉涛, 吴莉, 魏小星, 刘文辉, 陈有军, 何克燕, 周青平. 河西走廊半干旱区12个紫花苜蓿品种生产性能及品质评价[J]. 草地学报, 2025, 33(9): 3088-3098.
[9]	安雯, 张新宇, 麻冬梅, 马巧利, 郎思睿, 刘晓霞. 紫花苜蓿MsNF-YB8基因的克隆及耐盐性分析[J]. 草地学报, 2025, 33(8): 2456-2466.
[10]	邹雨琪, 王志军, 刘丽英, 原野, 潘泽宇, 孟和高勒, 宝乐尔, 格根图. 螺旋藻多肽对苜蓿发酵品质和微生物群落的影响[J]. 草地学报, 2025, 33(8): 2685-2693.
[11]	吉凌鹤, 何傲蕾, 何峰, 李昌宁, 姚拓. 紫花苜蓿种子包衣材料筛选及其对种子萌发影响[J]. 草地学报, 2025, 33(8): 2728-2736.
[12]	陈彩锦, 马琳, 包明芳, 蒋庆雪, 张国辉, 张尚沛, 高婷, 刘文辉, 王学敏. WRKY基因家族在植物中的研究进展[J]. 草地学报, 2025, 33(7): 2059-2069.
[13]	何升然, 刘晓静, 韩天虎, 赵雅姣, 韩颜隆. 紫花苜蓿氮效率差异对其根际土壤养分特性及微生物群落特征的影响[J]. 草地学报, 2025, 33(7): 2150-2161.
[14]	吕艳贞, 姚兴洁, 张昭, 孙庆赢, 杨雨泽, 闫慧芳. 不同品种紫花苜蓿种子萌发期耐碱性评价与关键指标筛选[J]. 草地学报, 2025, 33(6): 1852-1861.
[15]	武涛, 宋福超, 曹文侠, 赵雅姣, 杨航, 王诗涛, 马玉颜, 胥成梅, 杨丽萍. 不同套种行数比对紫花苜蓿/玉米混合青贮品质的影响[J]. 草地学报, 2025, 33(6): 1961-1971.