肝脏是酒精的主要代谢器官,长期酗酒会导致肝功能紊乱等酒精性肝病,进而演变为酒精性肝炎、肝纤维化,最后甚至形成肝硬化和肝癌（Dugum & Mccullough 2015;Wang et al. 2018 ）。近年来,由于生活水平的不断提高,酒精性肝病逐年递增,已成为继病毒性肝炎之后肝损伤的第二大诱因（Nimantha & Day 2007）。酒精性肝病的病理学机制目前尚不十分明确,现认为主要与氧化应激、细胞因子、脂质过氧化、线粒体功能障碍和内质网应激等有关（丁晓东 2012）,其中氧化应激在酒精性肝损伤的发生和发展起到重要作用（Chenet al. 2020 ）。目前临床上酒精性肝损伤仍无令人满意的有效药物（Anstee et al. 2011 ）。寻找一种能有效提高肝脏抗氧化应激能力并缓解肝损伤的药物,是防治酒精性肝病的重要手段（Yi et al. 2020 ）。

牛樟芝Taiwanofungus camphoratus (M. Zang & C.H. Su) Sheng H. Wu et al.又称为牛樟芝、樟生薄孔菌、牛樟菇、红樟芝、樟菇、樟菰、樟窟内菰（戴玉成和李玉 2011;Wuet al. 2012 ）,生长在台湾本土特有树种牛樟树腐朽心材内壁上的一种真菌（Geethangili & Tzeng 2011）。牛樟芝在台湾民间用于治疗肝病具有很长的历史,现代研究表明牛樟芝含有多糖、三萜、甾体、琥珀酸及马来酸衍生物以及泛醌衍生物等多种活性物质,具有解酒保肝、抗氧化、免疫调节、抗炎、抗肿瘤等作用（Hu et al. 2014 ;Wu et al. 2019 ）。本文探讨了牛樟芝不同提取物包括醇提物、水提物、醇提后水提物和多糖对酒精诱导的HepG2细胞损伤的保护作用,旨在阐明牛樟芝解酒保肝的活性部位,为其开发利用提供实验依据。

1.1.1 仪器：MS105DU万分之一天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;SFG-02B电热恒温鼓风干燥箱,黄石市恒丰医疗器械有限公司;KQ-300 DE型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;VCX130超声波细胞粉碎仪,美国SONICS公司;Agilent 1200高效液相色谱,美国安捷伦公司;353040-16029细胞培养箱,美国赛默飞公司;SW-CJ-IF超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;TECAN M200酶标仪,瑞士帝肯集团公司;DMIL/DFC295倒置显微镜,德国Leica公司。

1.1.2 药材和试剂：牛樟芝由汕头市君研生物科技有限公司提供,经吴锦忠教授鉴定为多孔菌科、薄孔菌属牛樟芝子实体;核糖醇（批号：K22F8S29663）、岩藻糖（批号：ASIM7L15555）,上海源叶生物科技有限公司;阿拉伯糖（批号：15011315）、鼠李糖（批号：14102217）,上海士锋生物科技有限公司;葡萄糖（批号：D0806AS）、甘露糖（批号：M0425AS）,大连美伦生物技术有限公司;半乳糖（批号：100226-201105）,中国食品药品检定研究院;色谱级乙腈,德国默克公司;MEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、双抗（青霉素、链霉素）,美国Gibco公司;磷酸盐缓冲液（PBS）,新西兰Hyclone公司;活性氧（ROS）检测试剂盒,凯基生物科技发展有限公司;唑啉酮（PMP）、二甲基亚砜（DMSO）、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;谷丙转氨酶（ALT）测定试剂盒、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒,南京建成生物工程研究所。

牛樟芝药材切片干燥,粉碎后过40目筛,60℃干燥至恒重。牛樟芝粉末20g加入400mL的95%乙醇回流提取3次,每次2h,滤液浓缩真空干燥即得牛樟芝醇提物（ethanol extraction,EE）,药渣继续加入400mL蒸馏水回流提取3次,每次2h,滤液浓缩后真空干燥泵干燥即得牛樟芝醇提后的水提物（water extract after extraction by ethanol,WEE）。牛樟芝粉末加入400mL的蒸馏水回流提取3次,每次2h,滤液浓缩真空干燥即得牛樟芝水提物（water extraction,WE）。牛樟芝水提物加适量水超声溶解,加入无水乙醇至醇浓度为80%,4℃放置12h,离心（3 000r/min,15min）,沉淀以无水乙醇、丙酮洗涤两次,除去脂溶性成分、色素等,离心,60℃干燥即得牛樟芝粗多糖（crude polysaccharide,CP）。以葡萄糖作为标准品,多糖的总糖含量为(55.42±2.13)%（杨彬君等 2019）。

1.3.1 细胞的培养：HepG2细胞培养于含10% FBS,1%双抗的MEM培养基中,置于5% CO₂、37℃的培养箱中培养。待细胞铺满80%培养瓶时,采用1mL 0.25%胰酶消化2min,加入培养基终止消化,吹打,离心,以1:3的比例传代,继续培养用于后续实验。

1.3.2 不同浓度酒精和提取物对HepG2细胞活力的影响：取对数生长期的HepG2细胞,调整细胞浓度为2×10⁵个/mL,将细胞接种于96孔板中,每孔100μL,于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24h,弃去培养基,加入含有不同浓度的酒精和牛樟芝提取物培养基100μL,酒精终浓度为2%、4%、5%、5.5%、6%、7%和8%。WE、WEE和CP终浓度为50、100、200、300、400、600和800μg/mL,EE（以DMSO助溶,含量低于1%）终浓度为25、50、100、200、300和400μg/mL,每个浓度设置6个平行,细胞培养箱中培养12h,弃去培养基,加入1mg/mL的MTT溶液100μL,37℃继续培养4h后,弃去MTT溶液,加入150μL DMSO溶液,振荡60s,使甲臜颗粒溶解完全,使用酶标仪570nm处测定吸光度,按照下列公式计算相对细胞活力。

$细胞相对活力(\%)=\frac{A_{处理组}}{A_{空白组}}×100 \%$

式中：A_处理组为不同处理组的平均吸光度值,A_空白组为空白组的平均吸光度值。

1.3.3 不同提取物对酒精诱导HepG2细胞的保护作用：取对数生长期的HepG2细胞,调整细胞浓度为2×10⁵个/mL,将细胞接种于96孔板中,每孔100μL,于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24h,弃去培养基。将细胞分为空白组,模型组,不同提取物低、中、高剂量组,EE（6.25、12.5和25μg/mL）,WE（75、150和300μg/mL）,WEE和CP（100、200和400μg/mL）。空白组和模型组给予空白培养基,各给药组给予不同浓度的提取物,于37℃、5% CO₂中培养12h后,吸弃各组培养基,空白组加入空白培养基,模型组和各不同提取物给药组给予5.5%酒精,继续培养12h后,按照1.3.2方法测定吸光度,计算相对细胞活力。

1.3.4 WEE和CP对酒精诱导的HepG2细胞各生化指标的影响：取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为4×10⁵个/mL,将细胞接种于培养瓶中,每瓶5mL,于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24h,弃去培养基,PBS清洗,WEE和CP按照1.3.3给药方式进行处理,于1 500r/min离心3min收集细胞培养基上清液待测。细胞用PBS清洗两次,0.25%胰酶消化细胞,取PBS 500μL收集细胞,细胞超声破碎仪破碎细胞（功率130W,3s/次,间隔5s,持续2min）。参照ALT、AST试剂盒方法测定细胞培养液ALT、AST水平,参照SOD、CAT试剂盒方法测定胞内SOD、CAT活性,采用考马斯亮蓝法测定细胞内总蛋白含量。

1.3.5 WEE和CP对胞内ROS含量的影响：活性氧采用荧光探针DCFH-DA进行检测。取对数生长期的细胞,以2×10⁵/mL接种于96孔板中,每孔100μL,于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24h,弃培养基,PBS清洗,将细胞分为空白组、模型组、WEE和CP（100、200和400μg/mL）处理组,按照1.3.3给药方式进行处理,弃培养基后,加入10μmol/L的DCFH-DA荧光探针溶液100μL,于37℃培养箱中孵育20min,无血清的培养基洗涤3次,每孔加入PBS 100μL,酶标仪检测荧光强度,设置激发波长488nm,发射波长525nm,实验结果以给药组与空白组的平均荧光强度比表示。

1.4.1 多糖的水解及PMP衍生化：精密称取牛樟芝多糖10mg于具塞试管中,加入2mL的2mol/L三氟乙酸,密封,于110℃水解2h,取出冷却至室温,3mol/L氢氧化钠中和至pH为7.0,蒸馏水定容至5mL,进行PMP衍生化。精密称量葡萄糖5.88mg、半乳糖1.85mg、鼠李糖1.36mg、甘露糖1.55mg、阿拉伯糖1.35mg、岩藻糖1.18mg,10%甲醇定容至5mL,混匀,即得标准品混合溶液,取200μL标准品混合溶液,加入0.3mol/L氢氧化钠200μL,0.5mol/L PMP 200μL,混匀后于70℃水浴100min,取出冷却10min,加入200μL 0.3mol/L盐酸和200μL蒸馏水,吹打混匀后,加入1mL氯仿萃取,弃去氯仿层,重复3次,上清液用0.22μm滤头过滤待测。CP水解液取200μL,按上述“加入0.3mol/L氢氧化钠200μL”起操作,制备多糖样品的供试溶液（秦亚东等 2015）。

1.4.2 HPLC色谱条件：CP经水解衍生化后采用以下色谱条件进行分析：色谱柱为YMC- Pack-ODS-A C18（250nm×4.6mm×5μm）,柱温30℃,检测波长250nm,流速1mL/min,流动相乙腈-0.1mol/L醋酸铵,洗脱程序见表1。

1.4.3 线性关系考察：各单体标准品称量混合,配成的标准单糖混合溶液按照1.4.1的方法进行衍生化处理后进行HPLC分析,以峰面积和进样量建立回归方程。

1.4.4 方法学考察：标准单糖混合溶液进行衍生化后,连续进样6针,计算其相对标准偏差RSD,测得精密度。CP平行6份进行水解和衍生化后HPLC测定,计算各单糖含量的RSD值,测得重复性。CP经水解衍生化后于2、4、6、8、10、12、24h分别进样,通过峰面积计算RSD值,测得稳定性。称取6份CP,每份10mg,加入单糖标准品适量水解并衍生化,计算各单糖的加样回收率。

实验结果以 $\bar{x}±s$表示,采用SPSS21.0统计软件对实验数据进行统计分析。采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）检验进行组间比较,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

牛樟芝不同提取物的得率分别为：EE[(35.47±0.15)%]、WE[(11.74±0.01)%]、WEE[(5.08±0.04)%]和CP[(3.02±0.09)%]。EE的得率最高,表明牛樟芝醇溶性小分子含量相对较高;直接对牛樟芝进行水提,WE得率为11.74%,经过醇提后再水提,水提物的得率下降为5.08%。CP含量为3.02%,表明牛樟芝中多糖等生物大分子化合物含量相对较低。

随着酒精浓度的增大,细胞活力逐渐降低,酒精浓度≥5%对细胞增殖出现明显的抑制作用;5.5%酒精对细胞增殖具有明显的抑制作用,抑制率达到36.65%;6%酒精抑制率高达78.11%,与空白组比较具有极显著差异（图1）。构建细胞氧化应激模型,应当选择细胞活力在50%-70%之间的浓度作为造模浓度,细胞存活率过高则损伤不明显,存活率过低则细胞可能发生严重的不可逆损伤,不利于后期实验（Hu et al. 2014 ）。因此,本实验选择5.5%的酒精作用12h诱导HepG2细胞酒精性氧化损伤。与空白组相比,EE≤5μg/mL、WE≤400μg/mL、WEE≤300μg/mL和CP≤400μg/mL对细胞增殖无显著的抑制作用,当EE浓度≥50μg/mL开始对细胞表现出显著的抑制作用,IC₅₀为109.19μg/mL,说明EE具有较强的细胞毒活性;50μg/mL WEE和50、100μg/mL WE还表现出明显的促进细胞增殖的作用。而随着提取物浓度的增加,各不同提取物均表现出显著或极显著的细胞增殖抑制作用。因此,各不同提取物的预处理浓度分别为：EE（6.25、12.5和25μg/mL）,WEE（100、200和400μg/mL）,WE（100、200和300μg/mL）和CP（100、200和400μg/mL）。

与空白组比较,模型组细胞活力明显下降。与模型组比较,不同浓度的EE和WE预处理组细胞活力均无显著性变化;而200、400μg/mL WEE和100、200、400μg/mL CP预处理均能极显著提高细胞活力,对酒精诱导的HepG2细胞损伤具有明显的保护作用（图2）。本文通过检测WEE和CP对酒精诱导HepG2细胞损伤生化指标的影响,进一步明确其保肝活性。实验结果表明WEE和CP均表现出明显的细胞酒精性损伤保护作用,提示CP是牛樟芝中解酒保肝的重要活性成分之一。

与空白组比较,模型组的培养基中ALT、AST水平极显著升高,胞内的SOD和CAT活力极显著下降,表明5.5%酒精能对HepG2细胞造成明显的损伤。与模型组比较,100μg/mL的CP和WEE均能显著降低细胞培养液的ALT水平;预处理浓度增加后发现,200和400μg/mL的CP和WEE均能显著降低细胞培养液的ALT、AST水平,同时提高胞内的CAT活力;200和400μg/mL的WEE及400μg/mL CP能明显提高胞内的SOD活力（表2）。结果表明CP和WEE能显著提高细胞的抗氧化应激能力,改善酒精诱导的细胞氧化性损伤。

细胞内ROS检测采用荧光探针法进行检测,酶标仪检测荧光强度进行定量分析,采用DCFH-DA作为探针,DCFH-DA本身没有荧光,进入细胞内被酯酶水解为DCFH,DCFH不能通透细胞膜,从而使探针被标记在细胞内。若有ROS存在,DCFH被氧化生成无法穿透细胞膜的绿色荧光物质DCF,荧光强度与细胞内ROS水平成正比,荧光强度越强则ROS水平越高（Aranda et al. 2013 ）。

与空白组比较,模型组细胞内ROS水平极显著升高（图3）,表明酒精能诱导HepG2产生氧化应激损伤。与模型组比较,WEE的各剂量组和CP高剂量组均能极显著降低胞内ROS水平。实验结果表明WEE和CP能提高细胞的抗氧化应激能力,显著提高抗氧化酶的表达,降低胞内ROS水平,对HepG2细胞发挥保护作用。

2.6.1 线性关系考察：各单糖回归方程的相关系数都大于0.999,说明在线性范围内线性关系良好（表3）。

2.6.2 方法学考察：精密度实验结果显示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖相对标准偏差（RSD,n=6）分别为0.55%、1.11%、0.41%、0.74%、0.65%,表明仪器精密度良好;重复性结果显示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖RSD值分别为1.32%、3.4%、1.81%、3.2%、3.54%,表明该方法重复性良好;稳定性结果显示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖RSD值分别为0.91%、2.8%、0.74%、0.72%、0.52%,表明各单糖衍生物稳定性良好。加样回收率结果显示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖的平均加样回收率分别为100.52%、98.40%、99.30%、98.92%、103.22%。RSD值分别为2.98%、2.74%、1.31%、2.45%、1.11%,表明5种单糖加样回收率良好。

2.6.3 CP的单糖组成：牛樟芝单糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成（图4、图5）,其摩尔比为1:0.1622:6.651: 2.646:0.3929。因此,以葡萄糖含量最高,其次为半乳糖、甘露糖,与采用GC方法检测结果基本一致,但是略有差别,主要与CP的衍生化方法和检测手段有关（Yi et al. 2020 ）。

大量的研究表明,氧化应激是引起酒精性肝损伤的潜在机制,酒精在体内的氧化代谢物如ROS和乙醛会降低细胞的抗氧化能力,诱发肝脏的氧化应激,诱导细胞内的脂质、蛋白质、DNA的氧化损伤,影响细胞的正常功能（Wu & Cederbaum 2009;Chen et al. 2020 ）。SOD、CAT是生物体内重要的抗氧化酶,机体中的有害的超氧自由基经SOD催化转化为过氧化氢,再由CAT催化转化为无害的氧分子和水,共同起到清除ROS和抗氧化的作用（Gerin et al. 2016 ）。因此,提高机体的抗氧化应激,清除胞内过剩的ROS,对维持细胞的正常功能,改善酒精性肝损伤具有重要意义（Chuang et al. 2016 ）。

牛樟芝一直被台湾高山族当作一种解酒民间药物,被誉为“森林中的红宝石”（Kuang et al. 2020 ）。现代药理学实验表明牛樟芝菌丝的一种中性多糖对痤疮丙酸杆菌和脂多糖诱导的ICR小鼠肝损伤具有明显的保护作用（Hanet al. 2006 ）;菌丝糖蛋白antrodan能抑制氧化应激,对脂多糖诱导的Sprague-Dawley大鼠肝损伤起到明显的保护作用（Ker et al. 2014 ）;另外,牛樟芝的小分子化合物如泛醌（Zhang et al. 2017 ）、琥珀酸衍生物（Yi et al. 2020 ）和三萜（Wu & Chen 2016）等也被证实是牛樟芝的保肝的重要活性成分。已有的研究表明牛樟芝浓缩胶囊（黄褐色粉末状内容物）对酒精诱导的ICR小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用（王瑾等 2014）。牛樟芝子实体水提物对Wistar大鼠慢性酒精性肝损伤有明显保护作用（Huang et al. 2010 ）。但是,牛樟芝子实体多糖对酒精性细胞氧化损伤的保护作用尚未见相关报道。

本研究采用不同的提取方法提取牛樟芝子实体,得到了4个不同的提取部位（EE、WE、WEE和CP）,其中EE主要含有醇溶性小分子化合物;WE除了含有小分子化合物外,还有多糖、糖蛋白、蛋白等水溶性等生物大分子;WEE和CP则主要含有多糖、糖蛋白、蛋白等生物大分子。本文系统地比较了牛樟芝4个不同提取部位对酒精诱导HepG2细胞氧化损伤的保护作用,结果表明WEE和CP对酒精诱导的细胞损伤具有明显的保护作用,WEE和CP预处理组能显著提高胞内的SOD、CAT活力,降低培养液中ALT和AST含量,降低胞内ROS水平的升高,显著改善酒精诱导的细胞氧化应激损伤,而EE和WE则无明显的保护作用,其中EE对HepG2细胞还表现出极显著的细胞增殖抑制作用。因此,WEE和CP为牛樟芝细胞酒精性氧化损伤保护的活性部位,提示多糖等生物大分子是牛樟芝解酒保肝的重要活性成分之一。